C^˚ ۹۴

واسرشته سازی اولیه

۱

۱ دقیقه

۹۴^˚C

واسرشته سازی

۳۵

۱ دقیقه

۵۳

اتصال

۱ دقیقه

۷۲^˚C

بسط

۱۵ دقیقه

۷۲ ^˚C

بسط نهایی

۱

جدول ۳-۵- مواد لازم و مقدار هر یک از آنها برای تهیه محلول پایه PCR

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

غلظت برای یک واکنش ماده

Master mix 6 میکرولیتر
P1 0.25 میکرولیتر
P2 0.25میکرولیتر
cDNA 1میکرولیتر
میکرولیتر ۴.۵ H2O

۳-۱۰ روش تهیه­ ژل و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR
ژل الکتروفورز به صورت زیر تهیه و برای بررسی نتایج آزمون PCR مورد استفاده قرار گرفت.
یک گرم آگاروز در ۱۰۰ میلی لیتر بافر TBE ( 8/10 گرم تریس، ۵/۵ گرم بوریک اسید و ۷۳/. گرم EDTA در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر، ۸=PH) با جوشاندن حل شد. بعد از اینکه دمای محلول به ۵۰ درجه سانتی ­گراد رسید محلول ژل حاوی ۵/۰ میکروگرم در میلی­لیتر اتیدیوم بروماید به آرامی درون قالبی که دو طرف آن با چسب مسدود شده بود، ریخته شد. قبل از بسته شدن ژل شانه را طوری در داخل ژل فرو برده که انتهای دندانه­های شانه به کف قالب نچسبد. پس از بستن ژل چسب­ها از دو انتهای قالب حذف و شانه به آرامی خارج می­گردد و ژل به همراه سینی درون محفظه دستگاه الکتروفورز حاوی بافرTBE قرار می­گیرد. ۸ میکرولیتر از محصولPCR همراه با ۴ میکرولیتر رنگ کروزول رد (۱۰ میلی مولار کروزول در سوکروز ۱۰ درصد) مخلوط و درون چاهک­ها ریخته شد. یک چاهک هم به مارکر اختصاص داده شد. سپس ولتاژ دستگاه در ۱۰۰ ولت تنظیم و به مدت حدود ۴۰ دقیقه الکتروفورز انجام گردید بعد از رنگ بری با آب مقطر ژل بر روی صفحهUV Transilluminator مورد بررسی قرار گرفته با بهره گرفتن از دستگاه gel documentation از آن عکس برداری شد.
۳-۱۱- مقایسه توالی نوکلئوتیدی نژادهای PVYبا توالی مشابه در سایر جدایه های موجود در بانک ژن
محصول نهایی PCR، به منظور تعیین ترادف به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد و با دستگاه Atomatic Sequencer 3730 XL تعیین ترادف گردید این ترادف­ها با ترادف سایر جدایه­های PVY موجود در بانک ژن توسط برنامه Clustal X همردیف و مقایسه شد و مشابهت نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی بین آنها در برنامه MegAlign محاسبه شد. درخت فیلوژنتیکی حاصل از همردیف سازی ترادف­ها توسط برنامه MEGA5 به روش Neighbor-joining با متد Kimura-2 بدست آمد و به وسیله نرم افزار Treeview نیز مشاهده شد (Kumar et al. 2004).
جدول۳-۶ جدابه­های ویروس وای سیب­زمینی که CP آنها مقایسه شده است.