نشانگر ISSR نقشه‌یابی نشده‌اند اما می‌توانند برای اشباع نقشه‌های پیوستگی RFLP و SSR مورد استفاده واقع شوند. نقشه جو با ۶۰ نشانگر ISSR( با عنوان RAMPs در مطالعه مورد اشاره قرار گرفته است) که برای تمامی کروموزوم‌ها نقشه‌یابی شدند، اشباع شد(بکر^[۷۳] و همکاران، ۱۹۹۵). بسیاری از این نشانگر بین RFLPهای خوشه‌ای، خوشه‌های RFLP پیرامونی، در بالای کروموزوم‌ها و بخصوص در مناطق با تراکم پایین نشانگر RFLP، نقشه‌یابی شدند. در گندم‌های Einkorn، اما، نه نشانگر ISSR در موقعیت‌های نشانگر RFLP و یا نزدیک به آن، نقشه‌یابی شدند(کوجیما و همکاران، ۱۹۹۸). ISSRs همراه با نشانگر AFLP و RAPD در نقشه‌یابی ژنوم‌های اروپایی و ژاپنی صنوبر مورد استفاده قرار گرفتند(آرکاد و همکاران، ۲۰۰۰). نقشه پیوستگی ژنتیکی Citrus با بهره گرفتن از ۷۵ نشانگر ISSR که در طول همه گروه‌های لینکاژی گسترده شده بودند، اشباع شد(سانکر و همکاران^[۷۴]، ۲۰۰۱). همچنین نشان داده شد که میزان انحراف تفرق ISSRs نسبت به RAPDs پایین‌تر است. در سویا، ۵۸ نشانگر ISSR برفراز ۱۸ گروه لینکاژی RAPD/RFLP نقشه‌یابی شدند(سیمگن و همکاران، ۲۰۰۶).

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۱۴-۴-۳ برچسب‌زنی ژن^[۷۵] و گزینش به کمک نشانگر
نشانگرهای DNA با پیوستگی نزدیک به صفات مهم زراعی در برنامه‌های کاربردی اصلاح گیاه، نقش دارند. در برنج، یک نشانگر ISSR تولید شده بوسیله پرایمر (AG)8YC، به یک نشانگر(STS) تبدیل شد تا امکان شناسایی ژن بازگرداننده باروریRf-1، فراهم شود. این نشانگر همبارز می‌تواند در مدیریت ژنتیکی بذر هیبرید خالص مورد استفاده قرار گیرد(آکاجی^[۷۶]، ۱۹۹۶). این نشانگر هم‌بارز می‌تواند برای مدیریت خلوص ژنتیکی بذر هیبرید مورد استفاده واقع شود. در نخود، دو نشانگر ISSR، نشانگر UBC-855₅₀₀ حاصل از پرایمر (AG)8YTو نشانگرUBC-825₁₂₀₀ حاصل از پرایمر (AG)8Tبا ژن مقاومت به نژاد ۴ پوسیدگی فوزاریومی پیوستگی نشان دادند(راتناپارخ^[۷۷] و همکاران، ۱۹۹۸).
نشانگرهای نزدیکتر به ژن هدف بوسیله جایگزینی نوکلئوتیدهای متصل به انتهای ׳۵ یا ʹ۳ حاصل شده‌اند. اخیراً، ISSR-PCR در شناسایی دو نشانگر آللی غالب DNA، یکی پیوسته به فاز کوپلینگ و دیگری پیوسته به فاز ریپالژن یک لوکوس اصلیFgr، که نسبت فروکتوز به گلوکز در گوجه فرنگی را تنظیم می‌کند، استفاده شده است(لوین^[۷۸] و همکاران،۲۰۰۰). این محصولاتPCR، از دو واکنش ISSR-PCR با بهره گرفتن از (TC)8CCو (TC)8CG‌ بعنوان پرایمر، حاصل شدند. دیگر صفت مهم در تولید بذر هیبرید برنج یعنی نرعقیمی ژنتیکی حساس به دما، با یک نشانگر ISSR، به نام UBC-855₁₀₆₀، برچسب‌گذاری شد(هوساین^[۷۹] و همکاران، ۲۰۰۰). همچنین ISSRs برای تولید نشانگرهای اختصاصی صفت، اختصاصی ژن و اختصاصی گونه‌های مختلف جنس برنج استفاده شده‌اند(ردی و همکاران، ۲۰۰۲).
۲-۱۴-۴-۴ تعیین تناوب موتیف SSR
آنالیز ISSR، امکان درک سازمان(خوشه‌ای بودن یا نبودن)، تناوب و مقادیر چندشکلی تکرارهای توالی ساده متفاوت را در یک ژنوم ارائه می‌کند. در برنج و گندم، پرایمرهای مبتنی بر توالی‌های تکراری ساده دو نوکلئوتیدی، حداکثر تعداد باندها را ارائه کرده و بنابراین استفاده از آنها نسبت به SSRs با واحدهای (نوکلئوتیدی) بزرگتر، معمول‌تر است. پرایمرهای مبتنی بر موتیف پلی( (GAمتصل بهʹ۳، پنج برابر باندهای تولید شده بوسیله پرایمرهای مبتنی بر موتیف پلی(GT) را تولید کردند که نشان دهنده تناوب اندک یا عدم کلاستربندی موتیف (GT)است(بلایر و همکاران، ۱۹۹۹). با بهره گرفتن از ISSRsنشان داده شده که تکرارهای چهار نوکلئوتیدی در ژنوم‌های یوکاریوتی فراوان هستند و تترامرهای چهار نوکلئوتیدی AGAC و GACA در درون ژنوم گراس‌ها پخش شده‌اند(پاساکینسکین^[۸۰] و همکاران، ۲۰۰۰).
۳-۱۴-۴-۵ مطالعات در مورد انشعاب جمعیت‌های طبیعی
ثابت شده که نشانگرهای بسیار متنوع ISSR هسته‌ای در آزمون فرضیه‌های انشعاب، اینتروگروسیون و سیستماتیک، مفید هستند(ولف^[۸۱] و همکاران، ۱۹۹۸). تنوع بین و درون جمعیت‌ها می‌تواند با بهره گرفتن از نشانگرهای چند جایگاهی پراکنده مانند ISSR مقایسه شود. با بهره گرفتن از نشانگرهای ISSR نشان داده شده که میزان تنوع میان جمعیت‌های O. granulataمناطق مختلف(۴۹ درصد)، بیش از میزان تنوع میان جمعیت‌ها(۳۸ درصد) و یا درون یک جمعیت(۱۲ درصد) حاضر در یک منطقه مشخص بوده است(کیان^[۸۲] و همکارن،۲۰۰۱). نشانگر ISSRs نقش مهمی در حفظ حقوق واریته گیاهی، بدلیل بازده منحصر به فرد آن در تمایز گذاشتن حتی میان ژرم‌پلاسم‌های نزدیک، دارد. تا امروز، چندشکلی بیشتری با بهره گرفتن از ISSRs نسبت به سایر پروسه‌های ارزیابی شناسایی شده است(گوپتا و همکاران، ۱۹۹۴ و ویرک^[۸۳] و همکاران، ۲۰۰۰).
در بسیاری از مطالعات تعیین وسعت چندشکلی یا مقایسه سیستم‌های نشانگری تنها یک خانواده از ISSRs، برای مثال پرایمرهای مبتنی بر تکرار توالی‌های سه یا چهار نوکلئوتیدی، مورد استفاده قرار گرفته‌اند. چنین تکرارهایی در مقایسه با پرایمرهای مبتنی بر دو نوکلئوتید اندک بوده و استفاده از آنها ممکن است به طبقه بندی دقیق کمکی نکند. همچنانکه اطلاعات بیشتر در مورد وقوع و توزیع موتیف‌های SSR در دسترس قرار می‌گیرد، استفاده از پرایمرهایی که پوشش دقیق‌تر کل ژنوم را ارائه می‌دهند، میسر می‌شود. همچنین، ترکیبات متفاوت موتیف، نوکلئوتیدهای متصله به انتهای و طول پرایمرها می‌توانند مورد استفاده قرار بگیرند. استراتژی‌ها برای تشخیص چندشکلی اضافی می‌تواند شامل استفاده از ISSRs در ترکیب با پرایمرهای(جویشی و همکاران، ۲۰۰۰ و بکر و همکاران، ۱۹۹۵) RAPD یا AFLPدر همان واکنش یا هضم برشی محصولات ISSRباشد( بکر و همکارن، ۱۹۹۵). بنابراین، ترکیبات نامحدود موتیف و طول هر دو پرایمر و استفاده از آنزیم‌های برشی مختلف میسر است. انتخاب خوب پرایمرها، می‌تواند انگشت نگاری دقیق و بنابراین تخمین سریع تنوع ژنتیکی بویژه در مجموعه‌های بزرگ برای شناسایی مجموعه‌های مرکزی و الگوی توزیع جغرافیایی را میسر سازد(ردی و همکاران، ۲۰۰۲). طبیعت مولکولی چندشکلی تنها در صورتی شناخته می‌شود که قطعات استخراج شده از ژل توالی‌یابی شوند نشانگرهای ISSR مرتبط به صفات زراعی مهم، توالی‌یابی شده و بعنوان نشانگرهای STS در گزینش به کمک نشانگر (MAS) استفاده می‌شوند. بنابراین یک احتمال جالب، استفاده از ISSRs بعنوان پروب برای هیبریداسیون موضعی(in-situ)، به‌ منظور نقشه‌یابی فیزیکی مکان‌های همولوگ کروموزومی، است(پاساکیناسکین و همکاران، ۲۰۰۰). دیگر امتیاز استفاده از نشانگرهای ISSR، لینکاژ آنها با لوکوس‌های SSR است. اگرچه ریز‌ماهواره‌ها خودشان احتمالاً غیر عملکردی و از نظر انتخاب خنثی هستند، اما به سبب پیوستگی با مکان‌های رمز کننده مشهور هستند، بنابراین ISSRs ممکن است مناطق غنی از ژن را علامت گذاری کنند(کوجیما و همکاران، ۱۹۹۸). در جدول ۲-۳ به طور خلاصه برخی از مزایا و معایب نشانگر ISSR بیان شده.
۲-۱۵ مروری بر پژوهش‌های انجام شده
از نشانگر ISSR به طور گسترده برای تخمین تنوع ژنتیکی در سطح درون گونه‌ای و میان گونه‌ای در تعداد زیادی از گونه‌های گیاهی مانند، برنج( جویشی و همکاران، ۲۰۰۰) ، گندم(نگاوکا^[۸۴] و همکاران، ۱۹۹۷)، ارزن انگشتی(آجی‌باد^[۸۵] و همکاران، ۲۰۰۰)، سیب زمینی شیرین(هانگ و سان^[۸۶]، ۲۰۰۰) و بارهنگ(ولف و مورگان ریچارد^[۸۷]، ۱۹۹۸)، بکار گرفته شده‌اند. فانگ و همکارن)۱۹۹۷) نشان دادند که نشانگر قلاب شده ISSR بسیار مفید و تکرارپذیرتر از آیزوزایم‌ها، RFLP و RAPD در تجزیه تنوع ژرم‌پلاسم نارنگی سه ژرم‌پلاسم پرتقال سه برگی می‌باشد از نشانگر ISSR به عنوان وسیله‌ای در شناسایی ژنوتیپ‌ها و همچنین ساختار جمعیتی گونه‌های گیاهی ذرت(کنتاتی^[۸۸] و همکاران، ۱۹۹۵) و سیب زمینی شیرین(هانگ و سان، ۲۰۰۰)، پرتغال سه برگی(فانگ و همکاران، ۱۹۹۷)، و گندم(نگاکا، و همکاران، ۱۹۹۷)، استفاده شده است. ISSR نشانگر گزینش برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در کاکائو، بازدانگان و حتی قارچ‌هاست. در مطالعه‌ای بر لوپین سفیدLupinus albus ، مشخص شد که در میان ۱۰ پرایمر مورد استفاده، دو پرایمر برای شناسایی تمامی ۳۷ ژنوتیپ مورد مطالعه، کافی بودند( گیلبرت^[۸۹] و همکاران، ۱۹۹۹). همچنین، ۴ نشانگر برای تمایز ۳۴ رقم سیب زمینی(پروست و ویکنسون^[۹۰]، ۱۹۹۹) و و ۳ نشانگر برای تمایز ۱۶ ژنوتیپ توت قرمز کافی بودند(لانهم^[۹۱]و برنان، ۱۹۹۸).در یک پژوهش بورنت و برانچارد(۲۰۰۱) کمیت و کیفیت این روش را در چندین گونه گیاهی بررسی کردند و پارامترهای مختلف PCR، از جمله غلظت DNA، آغازگر، Mgcl2، dNTPS و مقدار آنزیم DNA پلیمراز و تعداد چرخه را مورد مطالعه قرار دادند. آنها به میزان اختصاصی بودن و تکرارپذیری ISSR تاکید نمودند.
دامارال جونیور^[۹۲] و همکاران(۲۰۱۳) به منظور بررسی تنوع ژنتیکی ذرت آجیلی ۵۲ توده، که ۲رقم آنها اجدادی و شاملteosinte و Tripsacum sp بودند را با بهره گرفتن از ۱۵ نشانگر ISSR، به ۹ گروه تقسیم کردند. در این مطالعه ۱۳۷ باند مشاهده شد که ۱۲۲ باند (۰۵/۸۹) چندشکلی نشان دادند. از نشانگر RAPD برای تعیین تنوع ژنتیکی و ارزیابی ارتباط ۱۱ رقم هیبرید زودرس ذرت استفاده شد که براساس تجزیه تحلیل نشانگر RAPD توسط ۱۰ ترکیب پرایمر تصادفی در کل ۱۹۹ باند مشاهده شد که ۲/۷۸ درصد از آنها چندشکل بودند. پیجک^[۹۳] و همکاران (۱۹۹۸) به منظور مقایسه بررسی تنوع ژنتیکی ۳۳ لاین‌خالص ذرت از نشانگرهای متفاوت RFLP، RAPD، SSR و AFLP استفاده کردند. که تعداد باندهای مشاهده شده برای RAPD 90 عدد، RFLP 253 و برای SSR،۲۱۳ عدد بود. برای نشانگر RAPD و RFLP میانگین تعداد آلل برای هر جایگاه ۸/۴ و تعداد الل‌های موثر ۲/۳ درصد بود. در حالی که برای SSRتعداد الل به میزان ۸/۶ درصد و تعداد الل های موثر به۴/۴ درصد افزایش یافت این در حالی است که این میزان برای دو نشانگرAFLP و RAPD دارای ارزش پایین‌تری(۴/۱ برای هردو) می باشد. سیباو^[۹۴]و همکان(۲۰۰۳) به منظور بررسی سطح چندشکلی و تهیه‌ی نقشه ژنتیکی ذرت نواحی گرمسیری از دو لاین‌خالص ذرت(برابر از نظر تولید دانه) از ۸۵۹ جفت توالی آغازگرها SSR استفاده کردند که از این ۸۵۹ آغازگرها، ۵۴ درصد از جفت آغازگرها به وضوح محصول PCR را تولید کردند. که در کل ۲۱۳ نشانگر چندشکل شناخته شده و برای تهیه نقشه‌ی ژنتیکی استفاده شد. لیو^[۹۵] و همکاران (۲۰۰۳) ۲۶۰ لاین‌خالص ذرت را به عنوان نماینده‌ای از تنوع ژنتیکی‌ لاین‌های مهم در مناطق معتدل و بسیاری از لاین‌های مهم گرمسیری و نیمه گرمسیری، با بهره گرفتن از ۹۴ جایگاهSSR به منظور بررسی چندشکلی موجود در آنها، مورد بررسی قرار دادند که در بین آنها ۲۰۳۹ آلل مشاهده شد. بر اساس تجزیه تحلیل خوشه‌ای تنوع ژنتیکی و تعداد آلل بیشتری در ارقام گرمسیری و نیمه گرمسیری نسبت به همتایان آنها در نواحی معتدله وجود داشت. کامرتاپی و همکاران(۲۰۱۲) تنوع ژنتیکی در ۹۸ توده بومی ترکیه( ۴۸ ناحیه مختلف) را با ۲۸جایگاه SSR(مولکولی) و ۱۹ صفت مورفولوژیکی مختلف(فنوتیپی) مورد مطالعه قرار دادند که در مجموع ۱۷۲ آلل SSR آشکار شد. فاصله ژنتیکی بین ارقام بومی محدود و در دامنه ۱۸/۰-۱۶/۰(به طور متوسط۳۵/۰) قرار داشت. بر اساس دندروگرام UPGMA تجزیه تحلیل برای صفات مورفولوژیکی و داده‌های SSR به ترتیب روشن شد که ارقام بومی ذرت از منطقه جفرافیایی مشابه اغلب در دسته‌ه ای مختلف قرار می‌گیرند و وابستگی مثبت و منفی بین صفات مورفولوژیکی و کشاورزی وجود داشت. گارسیا^[۹۶] و همکاران(۲۰۰۴) به منظور مقایسه کارایی انواع نشانگرها و انتخاب بهترین آنها ۱۸ لاین‌خالص ذرت با نشانگرهای مختلف را مورد بررسی قرار دادند. در این بین نشانگرهای غالب AFLP و RAPD ارزشCV پایین‌تری نشان دادند. در حالی که نشانگرهای هم‌بارز SSR و RFLP دارای ارزشCV بالاتری بوده و دارای شاخص PIC بالاتری از نشانگرهای غالب بودند و علاوه بر این در همه‌ی نشانگرها به جز RAPD، میزان فاصله ژنتیکی با عملکرد دورگه‌ها و هتروزیس آنها ارتباط داشت. لو و برنارد^[۹۷](۲۰۰۱) تنوع ژنتیکی ۸ لاین‌خالص کنونی و ۳۲ لاین‌خالص قدیمی( Zea maize L.) که حداقل یک بار در برنامه اصلاحی ذرت بکار رفته بودند را با بهره گرفتن از ۸۳ نشانگر ریزماهواره مورد بررسی قرار دادند. میانگین فاصله ژنتیکی برای لاین‌های‌خالص کنونی ‌۶۵/۰ و برای لاین‌های قدیمی ۶۷/۰ بود. اختلاف از لحاظ آماری معنی‌‌دار نبود این نتیجه نشان داد که تفاوت قابل ملاحظه‌ای از لحاظ تنوع ژنتیکی در سطح جمعیتی بین لاین‌های‌خالص جدید و قدیم ذرت و جود ندارد و این تنوع ژنتیکی تنها در سطح ژنی و نه در سطح جمعیتی کاهش یافته است. علاوه بر این محققین بیان کردند که بهکارگیری دیگر خزانه‌های ژرمپلاسم ذرت، ایجاد خزانه‌های ژرمپلاسمی ذرت و حتی بهکارگیری ژرمپلاسم‌های بیگانه می‌توانند برای بهبود در پیشرفت برنامههای اصلاحی ذرت مفید واقع شوند. فاطمه دهقان نیری و همکاران( ۱۳۸۴) شباهت ژنتیکی ۴۶ لاین‌خالص ذرت در طی یک برنامه اصلاحی با بهره گرفتن از نشانگر ریز‌ماهواره مورد بررسی قرار دادند. تکثیر با ده جفت نشانگر ریزماهواره صورت گرفت تعداد آلل‌های در هر جایگاه از ۱۴-۳ متغیر بوده و در مجموع ۶۹ آلل شناسایی شد. بر اساس دندروگرام حاصله، ۴۶ لاین مورد مطالعه در سه گروه قرار گرفتند. در این مطالعه PIC برای جایگاه‌های ریزماهواره‌ای بین ۹۱-۵۴ درصد متغیر بوده و میانگینی برابر ۷۳ درصد داشت. السادی ادریس و همکاران(۲۰۱۲) در بررسی تنوع ژنتیکی ۹ لاین‌خالص ذرت از ۸ نشانگر ISSR استفاده کردند که در مجموع سطح بالای چندشکلی (۶۹ درصد) آشکار شد. حسن نژاد و همکاران(۱۳۸۴) در بررسی تنوع ژنتیکی ۷ لاین‌خالص زودرس ذرت با بهره گرفتن از نشانگر مولکولی RAPD، ۳۸۰ باند شمارش کردند که در مجموع ۲۴۳(۶۴ درصد) باند چندشکلی مشاهد کردند. در نتیجه لاین‌های‌خالص در فاصله ژنتیکی ۳۸ درصد به دو گروه اصلی تفکیک شدند. فرناندز^[۹۸] و همکاران (۲۰۰۲) تنوع ژنتیکی ۱۶ رقم جو را با بهره گرفتن از ده نشانگر RAPD و ده نشانگر ISSR مورد مطالعه قرار دادند. درصد چندشکلی نشانگر ISSR(83 درصد) بیشتر از نشانگر RAPD(63 درصد) بود ولی هر دو نشانگر توانایی تفکیک ارقام جو را بر اساس دو یا شش ردیفه بودن و همچنین بهاره و زمستانه را داشتند. آنها استفاده هم‌زمان از نشانگرها را برای بدست آوردن اطلاعات بیشتر و سریعتر برای انگشت‌نگاری DNA را مفید ارزیابی کردند. باندهای بدست آماده از نشانگر ISSR در مجموع ۲۲۸(به طور میانگین برای هر آغاز‌گر ۴/۲۲) بود که باندهای حاصل در دامنه ۲۰۰-۱۵۰۰bp قرار داشتند. ساروات^[۹۹] و همکاران (۲۰۰۸) در بررسی تنوع ژنتیکی ۲۴ گیاه دارویی خارخسک از ۲۱ نشانگر ISSR و RAPD استفاده کردند و در مجموع از نشانگر ISSR، ۲۳۹ باند در محدوده Kb5/2- 4/0 تکثیر، و ۶/۷۳ درصد چندشکلی نشان دادند. حق‌پناه و همکاران(۱۳۹۰) در بررسی تنوع ژنتیکی ۳۱ ژنوتیپ گیاه گزنه Urtica dioica با بهره گرفتن از ۸ نشانگر ISSR، ۲۹ باند مشاهده کردند و در مجموع ۴/۶۷ درصد چندشکلی مشاهد شد راس^[۱۰۰] و همکاران (۲۰۰۳) به منظور بررسی اختلاف ژنتیکی ۸ گونه استنوفیلا از ۱۴ جفت نشانگر ISSR استفاده کردند که در مجموع دویست و سی قطعه تکثیر شد. آنها به این نتیجه رسدند که موتیف‌های دی‌نوکلوتیدی (GA)₉Tدر مقایسه با دی، تری و تترا‌نوکلئوتید تولید تعداد بیشتری قطعه DNA کرده و چندشکل بیشتری را نشان می‌دهند، همچنین پی‌بردند که فراوانی بالایی از پلی‌موتیف‌های GA ریزماهواره‌ها در ژنوم استنوفیلا وجود دارد. و تنوع در درون و بین جمعیت‌ها با بهره گرفتن از آغازگرهای ISSR قابل مقایسه بود. کیان و همکاران(۲۰۰۱) با بهره گرفتن از آغازگر ISSR نشان دادند که مقدار تنوع بین جمعیت‌های Oryza granulate از مناطق مختلف ۲/۴۹ درصد است. تنوع بین جمعیت‌های مربوط به یک منطقه ۳۸ درصد و در درون جمعیت ۱۲ درصد است آنها در بررسی تنوع ژنتیکی پنج جمعیت برنج از دو منطقه با ۲۰ نشانگر RAPD و ۱۲ نشانگر ISSR گزارش نمودند که نشانگر ISSR قادر است چندشکلی بیشتری(۴۶ درصد) را نسبت به نشانگر RAPD( 6/30 درصد) نشان می‌دهند. در نتیجه مشخص شد که نشانگر ISSR یک نشانگر قوی برای مطالعه تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌ها است. یو^[۱۰۱] و همکاران(۲۰۰۵) روابط ژنتیکی ۷۰ ژنوتیپ از جنس هزار برگ (Houttuynia Thunb) را توسط نشانگرهای RAPD و ISSR مورد مطالعه قرار دادند. نتایج پژوهش آنها نشان داد که چندشکلی بالایی در سطح DNA ژرم‌پلاسم این گیاه وجود دارد. و نشانگرهای RAPD و ISSR توانایی تشخیص ژنوتیپ‌ها را از یکدیگر داشتند. و در نهایت مشخص شد کارایی نشانگر ISSR بیشتر از RAPD بوده. در تجزیه کلاستر بوسیله روش UPGMA نشان داد شد که گروه‌بندی براساس نشانگر ISSR و بر مبنای ضریب جاکارد(ضریب تشابه بین صفات کیفی) ژنوتیپ‌ها با تعداد کروموزوم مشابه در یک گروه قرار می‌دهد. در این بررسی تجزیه براساس نشانگر RAPD بر مبنای ضریب تشابه جاکارد بیشتر وابسته به توزیع جغرافیایی ارقام بود. بلایر و همکاران)۱۹۹۹) در بررسی ۵۹ رقم برنج توسط نشانگر ISSR و AFLP گزارش کردند که درصد چندشکلی مشاهده شده توسط ISSR نسبت به روش AFLP بیشتر است. آغازگرهای دو نوکلئوتیدی نسبت به آغازگرهای سه، چهار، پنج نوکلئوتیدی و سایر آغازگرهای تخصصی چندشکلی بیشتری نشان دادند. نتایج تحقیق آنها نشان داد که نشانگر ISSR یک تکنیک مناسب برای تعیین تنوع ژنتیکی و شناسایی سریع ارقام برنج است و می‌توان از آن در تعیین خصوصیات توده‌های بومی و ژرم‌پلاسم بین‌المللی برنج استفاده نمود. یوزیا و همکاران(۲۰۰۷) تنوع و روابط ژنتیکی بین ۴۸ ژنوتیپ گلرنگ را توسط ۲۲ پرایمر ISSR بررسی کردند. از ۴۲۹ باند تکثیر شده ۳۵۵ باند (۷/۸۲ درصد) چندشکلی نشان دادند. تمامی ۴۸ ژنوتیپ توسط نشانگرهای ISSR قابل شناسایی هستند و بر اساس ضریب ^[۱۰۲]GS(شباهت ژنتیکی نی ۷/۸۲ درصد) با بهره گرفتن از روش UPGMA ارقام گلرنگ به ۹ گروه تقسیم شدند. روابط ژنتیکی بین ارقام از قاره‌های مختلف نزدیک به هم و تنوع ژنتیکی ارقام آسیایی بیشتر از اروپا بود. همچنین نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی ارقام گلرنگ ار مراکز تنوع هند و خاورمیانه نسبتا بالا است. آنها اظهار نمودند که ISSR یک سیستم نشانگر موثر و امید بخش برای مطالعه تنوع ژنتیکی بین ارقام گلرنگ و حاوی اطلاعات مفید برای روابط ژنتیکی است. ISSRها برای آنالیز تنوع از لحاظ کیفیت و کمیت داده‌های خروجی در مقایسه با سایر نشانگرها خیلی مفیدتر هستند. همچنین سونانته و پیجنان^[۱۰۳](۲۰۰۱) با مطالعه تنوع ژنتیکی ۴۶ ژنوتیپ عدس توسط نشانگر ISSR و RAPD گزارش کردند که نشانگر ISSR ابزاری قدرتمندتر در تشخیص ژنوتیپ‌های نزدیک به هم می‌باشد. نگاکا و همکاران(۱۹۹۷) با مقایسه نشانگر ISSR و RAPD بر روی ارقام گندم نتایج مشابهی را گزارش کرند. سیام کومار^[۱۰۴] و همکاران(۲۰۰۷) تنوع ژنتیکی ۱۵ جنس زردچوبه را توسط آغازگرهای ISSR و RAPD مورد مطالعه قرار دادند. تجزیه کلاستر بر مبنای UPGAM بر اساس دو نشانگر نشان داد که گروه بندی(ضریب تشابه جاکارد۶۶/۰) تا حدی با گروه‌بندی بر مبنای صفات مورفولوژیک مطابقت دارد. کیم^[۱۰۵] و همکاران(۲۰۰۲) تنوع ژنتیکی و روایط ژنتیکی مجموعه ژرم‌پلاسم کنجد را توسط ۱۴ نشانگر ISSR مورد مطالعه قرار دادند. آنها از ۷۵ ژنوتیپ کره‌ای و خارجی استفاده نمود. ۷۵ ژنوتیپ به ۷ دسته طبقه‌بندی شدند. بزرگترین گروه شامل ۲۵ ژنوتیپ از ژنوتیپ کره‌ای(۸ لاین اصلاح شده کره‌ای و ۱۷ ژنوتیپ از ژرم‌پلاسم کنجد) بود. دندروگرام تقسیم‌بندی واضحی را میان ژنوتیپ‌های کنجد براساس مبدا جغرافیایی نشان نداد. تمامی لاین‌های کره‌ای (بجز یک رقم) در یک گروه قرار گرفتند، در حالی که لاین‌های اصلاحی در گروه‌های متفاوت پراکنده شده بودند. این امر بیانگر تنوع ژنتیکی بالا در بین لاین‌های اصلاحی بود. گالوان^[۱۰۶] و همکاران(۲۰۰۳) با مطالعه تنوع ژنتیکی ۱۳ ژنوتیپ لوبیای معمولی توسط ۹ نشانگر ISSR و مقایسه آن با نشانگر RAPD گزارش نمودند که نشانگر ISSR درصد چندشکلی بیشتری( ۴۰ درصد) را نسبت به نشانگر RAPD( 25 درصد) نشان می‌دهد. اندازه باندهای تکثیر شده بین ۲۴۰۰-۳۰۰ جفت باز بود. آنها اعلام کردند که ISSR ابزار مناسبتری برای مطالعه تنوع ژنتیکی و شناسایی منشاء ژنی و ژنوتیپ‌های لوبیا است و میانگین تعداد باندها تولید شده برای هر آغازگر چندشکل ۸ عدد و حداکثر آنها ۱۲ عدد بود است. عباسپور و شکوهی‌فر(۱۳۹۰) در بررسی انگشت‌نگاری تعدادی از ارقام خربزه ایرانی در مجموع بیست نشانگر RAPD و ISSR را مورد استفاده قرار دادند که از بین آنها، ۱۲ آغازگر مناطقی از ژنوم ارقام مورد مطالعه را تکثیر نمودند. که اندازه و وضوح باند‌های مورد مطالعه بسیار متغیر بود. با توجه به جدول نتایج آنالیز مولکولی در میان ۱۲ نشانگر مورد مطالعه تنها نشانگرهایRAPD : PSh6، UBC29و ISSR: PSh8 توانستند الگوی الکتروفوزی متمایزی را میان ارقام نمایان سازند.
لی^[۱۰۷] و همکاران (۲۰۰۲) به منظور بررسی تنوع ژنتیکی ۵۸ لاین‌خالص ذرت برای تولید ذرت هیبرید چین و یک گونه Zea luxurians از ۴۰ ترکیب نشانگریSSR استفاده نمودند. در مجموع ۲۵۹ الل تشخیص داده شد ارزش PIC با بهره گرفتن از فرمول اسمیت و همکاران محاسبه گردید که میزان آن در دامنه ۸۹/۰-۱۴/۰ متغیر و به طور میانگین ۶۰/۰ می‌باشد. اینبردلاین‌های حاصل در نهایت به هشت گروه تقسم شدند علاوه بر این، این هشت گروه در ۴ گروه هتروتیک ریدیلودنت، لنکستر، TSPT و LDHG که هیبریدهای امریکا از آن بدست آمده قرار گرفتند در نهایت نتیجه گرفتند که از این نشانگر، می‌توان به عنوان نشانگری مناسب برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در ژرم پلاسم ذرت به دلیل چندشکلی بالا و شناسایی شجرنامه استفاده نمود. پورساربانی و همکاران(۱۳۸۴) ۶۳ لاین‌خالص ذرت با بهره گرفتن از ۱۰ ترکیب آغازگری AFLP جهت تعین گروه‌های هتروتیک و شناسایی نشانگر‌های متصل با صفات مهم زراعی را مورد مطالعه قرار‌ دادند و در مجموع ۲۸۴ باند چند شکل مشاهده کردند. گروه‌بندی اولیه لاین‌های خالص با بهره گرفتن از داده‌های مولکولی بر اساس الگوریتم UPGMAو تجزیه خوشه‌ای لاین‌ها را به ۸ گروه تقسیم نمود‌.در این مطالعه محتوای اطلاعات چندشکلی آغاز‌گری از ۰۲/۰ تا ۷۱/۰ متغیر بود. با بررسی باندهای چندشکل، نشانگر اختصاصی بین لاین خالص ذرت شناسایی شد. گیسی^[۱۰۸] و همکاران (۲۰۰۲) به منظور بررسی تنوع ژنتیکی درون و بین گونه‌ای شش لاین خالص ذرت( B73, CM105, Mo17 Oh43, W153 و Wf9) که از ۱۴ منبع اصلاح ژرم‌پلاسم ذرت بدست آمده بودند از ۴۴ نشانگر SSR استفاده کردند؛ در مجموع ۱۳۷ آلل مشاهده شده. که هر جایگاه در دامنه‌‌ی بین ۶-۱ آلل داشتند و تنوع ژنتیکی بین گونه‌ای ۸/۸۷، درون گونه‌ای ۶/۴ درصد و تشابه ژنتیکی بین اینبرد لاین‌ها بیشتر از ۸۵ درصد بودند. میوم و دیودلی^[۱۰۹](۱۹۹۴) در مطالعه‌ای که در ایالات متحده بر روی ۱۴۸ اینبردلاین ذرت با بهره گرفتن از ۴۶ نشانگر RFLP انجام گرفت، لاین‌های‌خالص حاصل به دو گروه هتروتیک تقسیم شدند گروه اول از لنکسترشورکراپ و گروه دوم نیز از BSSS مشتق شده که به یازده زیر گروه برگزیده شامل (B14, B37, N28,PA91 ,OH43, T8 ,B73, C103, Mo17, OH07 و Wf9)تقسیم شدند. لیو^[۱۱۰] و همکارن(۲۰۰۹) همکاران در بررسی ۷۷۰ لاین‌خالص ذرت چین و برزیل با بهره گرفتن از ۱۰۳۴ نشانگر SNP مشاهده کردند. اختلاف معنی‌داری در آلل‌های گروهای هتروتیک مختلف در ۲۰ درصد از جایگاه SNP وجود دارد که به نظر می‌رسد سطح قابل توجهی از تنوع ژنتیکی بین منابع اصلاحی وجود دارد. در این پژوهش ژرم پلاسم‌های چینی دارای بالاترین ارزشPIC، پس از CIMMYT و پایین ترین PIC مربوط به برزیل بود. با توجه به اینکه بیشترین اینبردلاین‌ها از سیمیت مشتق شدند بالاترین ارزشPIC مربوط به CIMMYT بود که در نهایت به وضوح دو گروه جداگانه با ژرم‌پلاسم گرمسیری و معتدل/ نیمه گرمسیری بوجود آمد. در این بررسی ژرم‌پلاسم مناطق معتدل به هشت گروه هتروتیک شامل گروه^[۱۱۱] BSSS و ۱۹ رقم چینی بود که جزء خانواده اینبردلاین B73 می‌باشد، گروه دوم شامل لنکسترشورکراپ و ۳۰ اینبردلاین با روغن زیاد می‌باشد که به خانودادهMO17 تعلق داشت، گروه سوم شامل SPT و ۳۴ رقم چینی، گروه چهارم تروپیک۱ شامل ۲۶ اینبردلاین ذرت بلوری ((LGB)گروه پنجم PB یا تم تروپیکI که شامل ۳۴ اینبردلاین چینی بوده و وابسته به هیبریدP78599 ، US بود، گروه ششم، گروه هتروتیک PA شامل ۳۸ اینبردلاین چینی مشتق شده از Ye478 و Shen5003، گروه هفتم تروپیک ۲ شامل ۲۱ اینبرلاین سیمیت و گروه هشتم تروپیک ۳ شامل ۴۳۴ اینبردلاین از ایالات متحده، برزیل و چین بود. این گرو‌های هتروتیک سازگار با الگو‌های شناخته شده هتروتیک بودند. چوکان و همکاران(۲۰۰۶) در گروه‌بندی ۵۶ لاین‌خالص ذرت ایران را به با ۴۶ نشانگر SSR انجام دادند. که در مجموع ۲۲۵ الل مشاهده کردند. از طرفی ارزش PIC حاصل از جایگاه SSR در محدوده‌ی ۲۳/۰ -۷۹/۰ به طور میانگین ۵۹/۰ قرار داشت در این گروه‌بندی با بهره گرفتن از روش UPGMA لاین‌های‌خالص ایران در فاصله ژنتیکی ۳۹% به چهار گروه هتروتیک (یک گروه کنترل کننده که از سمیت شاملCML051 و CML292) تقسیم شدند. که در گروه A اینبردلاین B73 و در گروهB اینبردلاین MO17 قرار داشتند که این دو گروه شامل لاین‌های لنکسترشورکراپ و ریدیلودنت می‌باشند. در این گروه‌بندی بالاترین فاصله ژنتیکی مربوط به ریدیلودنت و لنکستر شورکراپ بود در این الگو محصولات با عملکرد بالای هیبرید را تولید کردند البته گروه‌های هتروتیک دیگر نیز پیشنهاد شد. سینیور و همکاران(۱۹۹۸) به منظور بررسی ۹۵ لاین‌خالص ذرت که لنکستر و رید نیز جزء آنها بودند از ۷۰ آغازگر SSR استفاده کردند. که در مجموع ۳۵۶ آلل مشاهد شد که ارزش PIC با بهره گرفتن از فرمول  برای جایگاه‌های SSR در دامنه ۹۲/۰-۱۷/۰، به طو میانگین ۵۹/۰ بدست آمد. که در این بین تکرارهای دو نوکلئوتید SSR میانگین بالایی PIC، ۶۷/۰ را نشان می‌دادند که با نتایج کار اسمیت و همکاران مطابقت داشت. در این بررسی در نهایت ۹ گروه بدست آمد در این گروه‌بندی لنکستر و رید در گروهA و ذرت شیرین و لنکستر در گروهH قرار گرفتند. که این گروه بندی با گروه بندی بر اساس گروه‌های بزرگ هتروتیک و نوع آندوسپرم مطابقت داشت. ایکسیا و همکاران(۲۰۰۵) به منظور بررسی تنوع ژنتیکی لاین‌ها‌خالص CIMMYT نواحی گرمسیری، نیمه گرمسیری و کوهستانی و ارتباط آنها با ذرت اروپا و امریکا از ۷۹ نشانگر SSR استفاده کردند که در مجموع ۵۶۶ آلل مشاهده شد (به طور میانگین ۵/۷ و ۱۶-۲ الل برای هر مکان). فاصله اصلاح شده راجر^[۱۱۲] برای هر جفت لاین به طور میانگین ۷۸/۰ و در دامنه ۴۵/۰ تا ۹۳/۰ قرار داشت. همچنین کنتاتی و همکاران(۱۹۹۵) به منظور بررسی توانایی نشانگر ISSR در بررسی چندشکلی، تنوع ژنتیکی نوزده رقم ذرت آجیلی و هشت رقم دندانه‌اسبی را مورد مطالعه قرار دادند در این بین آغازگرهای دو و سه نوکلئوتیدی به ترتیب ۸۷ و ۷۳ درصد چندشکلی نشان دادند و دامنه باندهای حاصل بین kb3-2/0 بود. از تجزیه خوشه‌ای و مولفه‌های اصلی برای گروه‌بندی لاین‌های دندانه‌اسبی و آجیلی برای اصلاح منبع هتروتیک استفاده شد در نهایت در فاصله ژنتیکی۴۰%، ۵ گروه هتروتیک بدست آمد که شامل ریدیلودنت، لنکسترشورکراپ، سوپرگولد، امریکای شمالی و امبرپیرل بودند و مشخص شد که این نشانگر ساده و کم هزینه بوده و به نظر می‌رسد چندشکلی ارتباطات مربوط به شجره را خیلی سریع نشان می‌دهد.
در آینده نه چندان دور حفظ مالکیت ژرم‌پلاسم امری بدیهی و ضروری است. تا امروز ISSRها چندشکلی بیشتری نسبت به هر روش دیگری نشان داده‌اند. لذا نقش مهمی را در ایمن کردن حقوق ژنوتیپ‌ها و ارقام گیاهی در تشخیص ژرم‌پلاسم‌ها ایفا می‌کنند(دامارال‌جونیو و همکاران، ۲۰۱۳). همچنین می‌توان از آن برای شناسایی الگوی پراکندگی جغرافیایی ارقام استفاده کرد. می‌توان نشانگرهای ‌ISSR را که با صفات مهم زراعی پیوستگی دارند توالی‌یابی نموده و از آن به عنوان نشانگرSTS در گزینش صفت مربوطه استفاده کرد(ردی و همکاران، ۲۰۰۲). در بررسی‌های انجام شده هر چند یک روش و یا ضریب کلی و الگوریتم خاص، برای تعیین روابط افراد و گروه‌بندی آنها وجود نداشت. در مطالعات مختلف با در نظر گرفتن اساس ژنتیکی و آماری روش‌ها و تطابق آنها با ماهیت ژنتیکی مواد ژنتیکی، روشی که بیشترین کارایی را داشت انتخاب می‌شد. اما همواره کاربرد روش های مناسب در تجزیه و تحلیل داده‌های مولکولی منجر به نتایج قابل اعتماد می‌شود. به عنوان مثال تعیین درست روابط ژنتیکی افراد و یا جمعیت‌ها در مجموعه‌ ژرم‌پلاسمی، بسیار مهم و نقطه اصلی در گروه‌بندی افراد و یا جمعیت است. که این امر نه تنها نیازمند استفاده از ابزارها و تکنیک‌های کارا برای تعیین تفاوت و یا شباهت افراد است بلکه استفاده از ضرایب فاصله و یا شباهت مناسب را با توجه به نوع تکنیک به کار رفته و ماهیت مواد ژنتیکی نیز لازم دارد.
فصل سوم
مواد و روش
۳-۱ مواد گیاهی
جمعیت‌ گیاهی مورد مطالعه در این پژوهش شامل ۲۷ اینبردلاین ذرت(جدول۳-۱) که از بین اینبردلاین تهیه شده در مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان(صفی آباد) انتخاب شده‌اند نحوه انتخاب براساس شجره موجود به صورتی بود که در نمونه انتخابی حداکثر تنوع موجود در بین اینبردلاین‌های مرکز موجود باشد. اکثر ژنوتیپ‌های موجود در این مرکز از طریق گزینش در بین جمعیت‌های آزاد گرده‌افشان دریافت شده از مرکز بین المللی سیمیت تهیه شده است. تعدادی از آنها نیز از طریق گزینش از بین جمعیت‌های حاصل از تلاقی ژنوتیپ‌های مختلف بدست آمده‌اند. همچنین دو اینبردلاین تجاری B73 و Mo17 که والدین Sc704 می‌باشند نیز در این مطالعه استفاده شدند. ارزیابی مولکولی لاین‌های‌خالص با کشت این بذرها در داخل گلدان ۲۰ سانتی‌متری در شرایط نوری و درجه حرارت مناسب در داخل گلخانه انجام گرفت. بعد از جوانه‌زنی بذور، برگهای اولیه هر لاین جدا گردید و به صورت جداگانه در فریز ۸۰- درجه‌سانتی‌گرداد منتقل و سپس عمل استخراج از نمونه‌های برگی انجام گرفت.
جدول۳-۱ مشخصات لاین‌های‌خالص مورد استفاده