نفوذ ضد یخ به سلول در زمان آبگیری باعث چروک خوردگی آن می شود اما در عین حال باعث می گردد که جنین ها در طی آبدهی شوک اسمزی را تحمل کنند. در طی آبگیری چون سرعت عبور آب معمولا سریع تر است. همزمان با جریان آب به سیتوپلاسم، سلولها ابتدا متورم می شوند تا دوباره تعادل اسمزی برقرار شود. سرعت و میزان تورم اسمزی وابسته به زمان آبدهی و حرارت است لذا کنترل دقیق حرارت و سرعت ذوب باعث می شود که ضد یخ بدون آنکه تورم اسمزی بیشتری بوجود آورد از سلول خارج می شود .(Rall, 1987)
دو روش ذوب در انجماد شیشه ای جنین موش مطرح بوده است:
در روش اول محلول انجماد شیشه ای به آهستگی از جنین خارج می شود. به این ترتیب که ابتدا غلظت خارج محلول به ۲۵% غلظت ضد یخ در محلول می رسد و باعث می شود جنین ها به حجم ایزوتونیک خود برگردند. در مرحله بعدی باقی مانده ضد یخ موجود در داخل سلول در طی دو مرحله در درجه حرارت اتاق از سلولها خارج می شود. جنینها دچار یک تورم موقتی در طی مرحله ورود آب به داخل سلول می شوند ولی پس از آن تعادل اسمزی با مایع خارج سلولی برقرار می شود
.(Smith et al., 1977)
روش دوم آبدهی براساس توانایی ساکاروز می باشد که اولین بار توسط Leibo و Mazur و Leibo مطرح شده است. در این روش ماده نفوذ ناپذیر به محلول انجماد اضافه می شود تا در زمان خروج ضد یخ از سلول از تورم اضافی جلوگیری کند. جنینها از محلول انجمادی به سالین محتوی ساکارز منتقل می شوند. در این حالت تورم موقتی در جنینها دیده می شود که علت آن ورود آب به سلول می باشد. پس از گذشت ۵ دقیقه سوسپانسیون جنینی در دمای اتاق گرم شده و جنینها سریعا با انتقال به محلول سالین ایزوتونیک آبدهی می شوند (Rall, 1986).
۱-۸-۹- سرعت انجماد
سرعت انجماد به مدت زمانی گفته می شود که محلول حاوی جنین از دمای آزمایشگاه به دمای مورد نظر (معمولا ۳۰- الی ۸۰- درجه سانتی گراد) می رسد. یکی از مهمترین عوامل موثر در انجماد سرعت انجماد است. در روش انجماد آهسته در صورتی که سرعت انجماد خیلی کند باشد به دلیل اعمال فشارهای اسمزی ناشی از افزایش غلظت مواد در بیرون سلول قسمت اعظم آب درون سلولی به بیرون راه می یابد و سلول به خوبی دهیدراته می شود. هر چند که خروج آب از سلول از یخ زدن آن جلوگیری می­ کند ولی در عوض فشارهای اسمزی شدیدی که به سلول وارد می آید می تواند به آن صدمه بزند و علاوه بر این مجاور بودن طولانی مدت ضد یخ با سلول در شرایطی که هنوز سلول فعالیت حیاتی دارد باعث می شود که سمیت ضد یخ به سلول صدمه بزند. از طرفی اگر سرعت انجماد به اندازه کافی کند نباشد آب درون سلولی به اندازه کافی خارج نشده و در جریان انجماد ممکن است بلورهای یخ تشکیل شود و با پیوستن به یکدیگر اثرات تخریبی خود را آشکار سازند. بدین ترتیب واضح است که سرعت انجماد حساب شده و دقیق برای یک انجماد موفق ضرورت دارد. مطالعات Mazure در سالهای ۱۹۶۶ ، ۱۹۷۰ و ۱۹۸۴ نشان داده که سرعت انجماد مناسب یک سلول به مقدار اب درون سلولی، نسبت سطح به حجم سلول، حرارت محیط و اسمولاریته محیط خارج سلول بستگی دارد .(Mazure, 1966)

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱-۸-۱۰- القاء یخ زدگی^[۷۴]
آب خالص معمولا در دمایی کمتر از نقطه انجماد آب ، یخ می زند. نقطه انجماد آب خالص در فشار یک اتمسفر صفر درجه است. در حالیکه آب معمولا در دمای ۲- درجه سانتی گراد یخ می زند و در صورتی که مواد ضد یخ به نسبتی که برای جنین بکار می رود در آن حل شده باشد تا حدود ۳- الی ۵- درجه سانتی گراد یخ نمی زند. این امر به دلیل آرایش خاص ملکولهای آب است که در برابر یخ زدن مقاومت می کنند. در صورتی که عواملی این نظم ملکولی را برهم بزند بلورهای یخ شروع به تشکیل شدن خواهند کرد. از جمله عواملی که می توانند باعث القاء یخ زدگی بشوند حرکات مکانیکی مانند تکان خوردن آب و قرار دادن قطعه ای از بلور یخ در آب سرد شده است. برخی از سلولها برای انجماد نیازی به القاء یخ زدگی ندارند ولی برای جلوگیری از پدیده فرا سرما و شروع دهیدراسیون جنین لازم است. اگر بلورهای یخ به موقع در محیط بیرونی جنین تشکیل نشود محلولی که جنین در آن قرار گرفته تا چندین درجه زیر صفر یخ نخواهد زد. چنین محلولهایی ممکن است حتی تا ۱۵ درجه سانتی گراد پایین تر از دمای انجماد محلول به حالت یخ نزده باقی بمانند یخ زدن تدریجی برای انجماد جنین حیاتی است زیرا یخ زدن با آزاد کردن گرمای پنهان ملکولهای یخ همراه است و از طرفی یخ زدن آب بیرون سلولی باعث افزایش فشار اسمزی شده و به خروج آب از جنین کمک می کند. زمانی که یخ زدگی در زمان خودش آغاز شود تشکیل و پیشرفت بلورهای یخ بصورت تدریجی روی می دهد در نتیجه حرارت آزاد شده خیلی کم است و همچنین افزایش فشار اسمزی تدریجی است ولی وقتی محلول در دمای ۱۵- درجه سانتی گراد و پایین تر یخ بزند تمام محلول بطور ناگهانی یخ خواهد زد و چنین پدیده ای از طرفی باعث افزایش ناگهانی حرارت محیط خواهد شد و از سویی بدلیل عدم خروج آب در زمان مناسب از جنین ، آب درون سلولی ممکن است یخ بزند. به هر حال هر یک از این اتفاقات ممکن است باعث صدمه دیدن جنین شود (Biggers et al., 1962).
۱-۹- اثرات زیانبار انجماد
۱-۹-۱- تاثیرات مخرب برودت
جنین بسیاری از گونه های پستانداران در اغلب مراحل به درجه حرارت ۱۰ درجه سانتیگراد حساس هستند که از جمله می توان به جنین خوک قبل از مرحله خروج از پرده شفاف (Hatching)، جنین گاو قبل از مرحله مورولا ، جنین گاو حاصل از لقاح در محیط کشت قبل از تشکیل حفره بلاستوسل اشاره کرد. احتمالا علت این حساسیت وجود قطرات چربی زیاد در سیتوپلاسم است (Nagashima et al., 1995). در انجماد شیشه ای با عبور سریع از درجه حرارت حساس می توان اثرات مخرب برودت را کاهش داد. در این حال باید اشاره کرد که میزان حساسیت گونه های مختلف و مراحل تکامل جنین بسیار متفاوت می باشد .(Kasai, 1998)
۱-۹-۲- تاثیرات زیانبار یخ خارج سلولی
وجود یخ خارج سلولی باعث وارد شدن آسیبهای مختلفی به جنینها می شود. همزمان با برداشت آب خارج سلولی غلظت ضد یخ بالا رفته و سلولها در معرض غلظت بالایی از ضد یخ و الکترولیتها قرار می گیرند و اگر آب گیری طولانی شود غلظت باز هم بالاتر رفته و احتمال آسیب خصوصا در درجه حرارت دمای زیر صفر افزایش می یابد (Mazur & Schneider, 1986). Schneider و Mazur (Schneider & Mazur, 1987) پیشنهاد کرده ­اند که وجود یخ خارج سلولی باعث وارد آمدن آسیب فیزیکی به سلول می شود زیرا با کاهش درجه حرارت میزان قطعات غیر انجمادی مرتبا افزایش یافته و علاوه بر آن تشکیل یخ داخل سلولی که برای حیات سلول کشنده است با انجام Seeding تحریک می شود. در انجماد شیشه ­ای ، سلولها از این گونه اثرات در امان هستند چرا که در خارج سلول بلور یخ وجود ندارد . در برخی موارد در طی ذوب یخ خارج سلولی در محلول انجماد شیشه ای تشکیل می شود که بنام devitrification خوانده می شود. تا زمانی که یخ در خارج سلول باقی مانده و وارد سلول نشود برای سلول مضر نیست (Kasai, 1998).
میزان کریستالهای خارج سلولی به دو عامل بستگی دارد :
- خروج ضد یخ پس از خروج از رقیق کردن آن
- سرعت انجماد
۱-۹-۳- تشکیل یخ داخل سلولی
تشکیل و رشد بلورهای یخ داخل سلولی برای جنین کشنده است. اگر کریستالهای یخ کوچک باشد ممکن است سلول زنده بماند، اما اگر قطعات یخ کوچک به هم بپیوندند، کریستالهای بزرگی از یخ تشکیل می شود. در طی انجماد خطر تشکیل یخ داخل سلولی همیشه وجود دارد که یا در طی ذوب اتفاق می افتد و یا از اثرات seeding است و توسط یخ خارج سلولی و در زمان سرد کردن القا می شود (Kasai et al., 1998) به منظور اجتناب از تشکیل یخ داخل سلولی باید پس از قرار دادن سلولها در ضد یخ عمل seeding برای محلول مورد نظر کمی پایین تر از نقطه انجماد آن صورت گرفته و به آرامی سرد شود تا با آبگیری تدریجی داخل سلول غلیظ شود اما به هر حال در انجماد شیشه ای شانس تشکیل یخ در داخل سلول خیلی کم است زیرا در خارج سلول یخ وجود ندارد.
۱-۹-۴- صدمات ناشی از تغییرات فشار اسمزی و مسمومیت شیمیایی
در صورتی که جنین ها به مدت طولانی در معرض محلول انجماد شیشه ای قرار گیرند دچار مسمومست شیمیایی و شوک اسمزی می شوند. در تحقیقی جنین ها با زمان های مختلف در معرض DMSO در دمای ۴ درجه سانتی گراد قرار گرفتند. زمان ۱۵-۱۰ دقیقه به خوبی تحمل شد. در صورت اضافه کردن میزان بسیار کمی DMSO به منظور افزایش نفوذپذیری، جنین ها دچار مسمومیت شیمیایی شدند (Leibo et al., 1974). اگر چه مشخص شده است که ضد یخها اثرات اختصاصی بر سلولهای بیولوژیک دارند (McIntyre et al., 1974). مکانیسم دقیقی که توصیف کند ضد یخ چگونه در سلول مسمومیت ایجاد می کند ناشناخته باقی مانده است. احتمالا هنگام مسمومیت شیمیایی سلول یا غشاء سلول تخریب می شود، یا بعضی از باندهای پروتئین ها باز شده و یا یک اثر اختصاصی بر سیستم آنزیمی حیاتی باقی می گذارد (Loomis, 1974).
همانطور که قبلا هم اشاره شد با کاهش زمان آبگیری، کاستن درجه حرارت هنگام آبگیری، کم کردن غلظت ضد یخ و با بهره گرفتن از ضد یخ با سمیت کمتر می توان از مسمومیت شیمیایی سلولها جلوگیری کرد(Bourton et al., 1979; Cocks et al., 1975; Miyamoto et al., 1978) و تاثیرات غیر مستقیم ضد یخها را هم نباید از نظر دور داشت.
ا-۹-۵- اثرات زیانبار ترک خوردن نمونه ها
گاهی دیده می شود وقتی که جنینهای منجمد شده از نیتروژن مایع بیرون آورده می شوند، ترک برداشته اند. این آسیب فیزیکی که به نام fracture damage خوانده می شود به علت تغییرات حجمی نامتقارن در نیتروژن مایع و سریع جامد شدن است. در انجماد تا ۵۰ درصد جنین ها ممکن است دچار آسیبهای فیزیکی شوند. کوششهایی به منظور کاستن صدمات ناشی از ترک خوردن صورت گرفته است ولی هنوز موفقیت کاملی حاصل نشده است.
در انجماد شیشه ای احتمال این صدمات کمتر از انجماد آهسته است. که شاید علت تشکیل شدن بلور یخ باشد، هر چند که در انجماد شیشه ای هم گاهی تا بیش از ۲۰ درصد جنین ها آسیب می بینند (Tiherington et al., 1995) در صورتی که انجماد و ذوب در داخل نی صورت گیرد می توان از این صدمات در امان بود. اگر نمونه ها با فرو بردن در ازت مایع منجمد شوند و بعد مستقیما در آب ذوب شوند، احتمال آسیب به زونا پلوسیدا افزایش پیدا کرده و پس از ۱۰ بار سیکل سرد کردن و ذوب این احتمال به ۷۵ درصد می رسد. در حالی که اگر جنین ها تدریجا سرد شوند، به این ترتیب که ابتدا به مدت ۳ دقیقه یا بیشتر روی گاز نیتروژن نگهداشته شوند و برای ذوب هم ابتدا به مدت ۱۵ ثانیه در هوای اتاق قرار داده و بعد در آب غوطه ور شوند ۱۰۰ درصد جنینها دارای زونای سالم خواهند بود. حتی اگر این سیکل ۱۰ بار هم تکرار شود نتیجه یکسان باقی مانده و میزان زنده ماندن تحت تاثیر تکرار دفعات انجماد شیشه ای و ذوب نمی باشد. در ضمن باید دانست که صدمات ناشی از ترک خوردن هم در طی تبرید و هم در زمان ذوب روی می دهد اما بیشتر در طی گرم شدن اتفاق می افتد
.(Renard et al., 1984)
۱-۹-۶- تورم اسمزی
بلافاصله پس از ذوب، سلولهای منجمد شده دارای ضد یخ نفوذ پذیر هستند که باید از سلول خارج شود. اگر سلولها مستقیما در یک محلول ایزوتونیک ذوب شوند احتمال آسیب ناشی از تورم اسمزی زیاد است زیرا آب با سرعت بیشتری نسبت به ضد یخ انتشار پیدا می کند. Mazure و Schneider نشان دادند که جنینهای تازه موش و گاو می توانند پس از آنکه تا دو برابر حجم اصلی خود متورم شدند همچنان زنده بمانند.
در تحقیقی برای بررسی حساسیت تخمکهای پستانداران و جنینها نسبت به تورم اسمزی، تخمکهای متافاز II موش و جنین موش در مراحل مختلف تکاملی را در محیط PBI هیپوتونیک به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد قرار دادند. سپس نمونه ها به محیط ایزوتونیک PBI منتقل شدند و توانایی آنها برای زنده ماندن براساس یکپارچگی بلاستومرها و یا قدرت تکاملی آنها در محیط کشت ارزیابی شد .(Perdo et al., 1997)
نتایج این تحقیق نشان داد که فشار هیپوتونیک باعث ایجاد تخریب فیزیکی در غشاء سلولی می شود تخمکها و جنین های همه مراحل تکاملی که منجمد نشده­اند، در صورتی که در محیط ایزوتونیک که غلظت آن نصف شده قرار گیرند تاثیر نمی پذیرند. اما گستردگی صدمات ناشی از محلول ایزوتونیک (غلظت ۳/۰-۲/۰) متغییر است و به مرحله تکاملی تخمک و جنین بستگی دارد. به عنوان مثال جنینهای یک سلولی به فشار هیپوتونیک کمتر حساس بوده و مورولا بیشترین حساسیت را نشان می دهد. وقتی که تخمک یا جنین های منجمد شده که در یک محیط ایزوتونیک ذوب شده اند بلافاصله در محلولهای هیپوتونیک قرار گیرند درصد زنده ماندن کمتر می شود که نمایانگر آن است که سلولهای منجمد شده بلافاصله پس از ذوب حساسیت بیشتری نسبت به تغییرات فشار اسمزی در مقایسه با نمونه های منجمد نشده دارند و حتی میزان کمی تغییر در تعادل اسمزی باعث کاهش میزان درصد زنده ماندن در برخی مراحل تکاملی می شود. بنابراین بسیار مهم است که در طی آبدهی به سلول، میزان تورم پس از ذوب به حداقل برسد .(Kasai, 1998)
۱-۹-۷- چروک خوردگی اسمزی
برای خارج کردن ضد یخ از سلول از یک محلول ساکارزی استفاده می شود که با خروج ضد یخ، سلول دچار چروکیدگی می شود که این حالت نیز آسیبهایی را به سلول وارد می کند .(Yang et al., 1990) به منظور آزمایش حساسیت به چروک خوردگی اسمزی، تخمکهای متافاز II و همچنین جنینهای مراحل مختلف تکاملی در محیط PBI با غلظتهای متفاوت از ساکارز به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سسپس به محیط ایزوتونیک PBI منتقل شدند و قدرت زنده ماندن آنها در محیط In vitro بررسی شد (Kasai, 1998)که تقریبا هیچ تخمک یا جنین تازه ( منجمد نشده) در محلول محتوی ۷۵/۰ مول ساکارز آسیب ندیدند. هر چند که در محلولهای ۵/۱-۱ مول ساکارز تخمکهای متافاز II و جنینهای هشت سلولی به فشارهای هیپرتونیک حساس بودند ولی جنینهای دو سلولی و بلاستوسیستهای ثانویه حساسیت کمتری را نشان دادند. این مراحل تکاملی مستقل از مراحل حساس به تورم هیپوتونیک است. وقتی که جنین یا تخمک موش منجمد شده در یک محلول ایزوتونیک آبدهی شده و سپس به سرعت به محلول هیپرتونیک منتقل گردد درصد زنده ماندن آنها کمتر از وقتی است که این پروسه با نمونه های منجمد نشده تکرار شود. لذا پس از آنکه ضد یخ در یک محلول هیپرتونیک از سلول خارج شد باید به یک محلول ایزوتونیک یا حداقل با هیپرتونیسیته کمتر منتقل گردد .(Kasai, 1998)
۱-۱۰- انجماد سریع و فوق سریع
علاوه بر روش انجماد کند و انجماد شیشه ای که کاربردهای وسیعی پیدا کرده و تحقیقات زیادی در این موارد در جریان است عده ای از محققین روش سریع و فوق سریع را برای انجماد جنین و تخمک پیشنهاد کرده اند. در روش انجماد کند از مواد ضد یخ در غلظت پایین استفاده می شود و جنین تا دمای ۳۰- تا ۸۰- درجه سانتی گراد به کندی سرد شده و سپس وارد نیتروژن مایع می شود در حالی که در روش انجماد شیشه ای از غلظت های بالای ضد یخ به مدت کوتاه استفاده می شود و سپس جنین ها با سرعت تا دمای ۱۹۶- درجه سانتی گراد سرد می شوند. روش انجماد سریع حد فاصل این دو روش است است یعنی از طرفی غلظت ضد یخ حدواسط دو روش قبلی است و از سویی سرعت انجماد بیش از ۲ درجه سانتی گراد در دقیقه است. روش انجماد سریع با توجه به موفقیتهای کمی که داشته هنوز به عنوان یک روش قابل اعتماد شناخته نشده است و در مورد روش فوق سریع نیز گزارشات اندکی در دسترس است. ذکر این نکته نیز خالی از فایده نیست که روش فوق سریع با توجه به استفاده از غلظت بالای ضدیخ در مدت زمان کوتاه شباهت زیادی به روش انجماد شیشه ای دارد. سلولهای مغز استخوان یکی از اولین سلول هایی بودند که روش انجماد سریع در مورد آنها به آزمایش گذاشته شد .(Leibo et al., 1970)
۱-۱۱- هدف
هدف از این تحقیق بررسی چند فرضیه در مورد اثرات انجماد شیشه ای بر روی مراحل مختلف رشد جنین موش سوری است.
تعیین مناسب ترین مرحله از رشد جنینی برای انجماد جنین
تعیین مناسب ترین غلظت برای ماده انجمادی در مراحل مختلف رشد جنینی
تعیین مناسب ترین زمان لازم برای مراحل انجماد و ذوب در مراحل مختلف رشد جنینی.
فصل دوم
مواد و روش ها
۲- مواد و روش ها
۲-۱- تجهیزات
تجهیزات مورد نیاز برای گرفتن اسپرم و تخمک بالغ ، انجام IVF ،انجماد شیشه ای و ذوب جنین ها عبارتند از :
انکوباتور (Labotect C200)
هود لامینار
استریو میکروسکوپ (Olympus SZX16)
فریزر -۲۰°C و یخچال معمولی ۴°C
میکروسکوپ نوری
هات استیج^[۷۵]