۲-۱۲- سنجش میزان استری شدن
۲-۱۲-۱- محلول‌های مورد نیاز
۲-۱۲-۱-۱- محلول EDTA 05/0 مولار
برای تهیه ۱ لیتر از این محلول، ۴/۳۷۰ گرم از پودر EDTA (۴/۳۷۰) را با آب مقطر به حجم ا لیتر رسانده می‌شود.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۱۲-۱-۲- محلول هیدروکسیل‌آمین‌هیدروکلرید^[۱۸۵] ۱ نرمال
برای تهیه ۱ لیتر از این محلول، ۴۹/۶۴ گرم از پودر هیدروکسیل‌آمین‌هیدروکلراید (۴۹/۶۴) را با آب مقطر به حجم ا لیتررسانده می‌شود.
۲-۱۲-۱-۳ - محلول سدیم‌هیدروکسید^[۱۸۶] ۶ نرمال
یرای تهیه ۱ لیتر از این محلول، ۴۰ گرم از سدیم‌هیدروکسید (۴۰) را با آب مقطر به حجم ۱ لیتر می‌رسد.
۲-۱۲-۱-۴- محلول ۵% جرمی وزنی کلرید‌آهن ^[۱۸۷]
برای تهیه ۱ لیتر از این محلول، ۵ گرم از کلرید‌آهن ۸ آبه را با آب مقطر به حجم ۱ لیتر رسانده شد.
۲-۱۲-۲- روش سنجش میزان استری شدن
۱) ۲۵۰ میکرولیتر از محلول استوک ۲۰ هر پروتئین استری شده برداشته شد.
۲) ۱۵۰ میکرولیتر از محلول EDTA ۰۵/۰ را به هر محلول استری اضافه گردید.
۳) ۲۵۰ میکرولیتر از محلول ۱ نرمال هیدروکسیل‌آمین‌هیدروکلراید را به محلول فوق اضافه کرده که این مرحله با تکان دادن مداوم باید همراه باشد.
۴) سپس ۱۰۰ میکرولیتر محلول سدیم‌هیدروکسید ۶ نرمال را به مخلوط حاصله اضاقه نموده.
۵) سپس مخلوط را به مدت ۵ دقیقه جهت هیدرولیز شدن در دمای ۷۵ حرارت داده و مشاهده شده است که در این مدت زمان واکنش کامل می‌گردد.
۶) بعد از سرد شدن محلول در دمای اتاق، ۸۰۰ میکرولیتر از اسیدکلریدریک ۱ نرمال به آن اضافه گردید. که این مرحله نیز با تکان دادن همراه است.
۷) بخش نامحلول به وجود آمده در محلول را با سانتریفوژ کردن در دور g9800 در دمای ۴ جداسازی کرده و دور ریخته و از محلول باقی مانده جهت انجام واکنش رنگی استفاده می‌کنیم.
۸) ۸۰ میکرولیتر کلریدآهن ۵% را به محلول مورد نظر که اکنون حجمش به mL5/1 رسیده است اضافه کرده و جذب آن را در طول موج ۴۷۵ نانومتر ثبت گردید.
۹) از محلول پروتئین ‌استری نشده نیز به همراه تمامی اجزاء اضافه شده جهت بلانک استفاده گردید.
۲-۱۲-۳- رسم نمودار استاندارد
جهت رسم منحنی استاندارد از نمونه‌های استری اسیدهای آمینه استفاده می‌کنند. ولی نمونه استاندارد دیگر پیشنهاد شده هم اتیل‌استات است. بدین ترتیب که از اتیل‌استات غلظت‌های مخنلفی تهیه کرده و در این غلظت‌ها جذب در ۴۷۵ نانومتر ثبت گردیده و سپس نمودار استاندارد آن را رسم شد.
۲-۱۲-۴- محاسبه میزان استری شدن
برای محاسبه میزان استری شدن نمونه پروتئینی، با توجه به نمودار استاندارد اتیل‌استات، جذب آن را در غلظت نمونه پروتئینی مورد نظر به دست آورده و با در نظر گرفتن جذب اتیل‌استات به عنوان ۱۰۰%، میزان استری شدن نمونه‌ها نسبت آن محاسبه شد .
۲-۱۳- روش UREA-PAGE
۲-۱۳-۱- آماده‌سازی محلول‌ها
۲-۱۳-۱-۱- تهیه بافر مهاجرت
۱۲ گرم تریس، ۶/۵۷ گرم گلیسین با آب مقطر به حجم دو لیتر رسانده می شود. سپس با بهره گرفتن از هم‌زن خوب مخلوط می‌گردد.
۲-۱۳-۱-۲- تهیه محلول رنگ‌آمیزی
برای تهیه این محلول ۶۰۰ میلی‌لیتر اتانول، ۱۰۰ میلی‌لیتر اسیداستیک و ۴ گرم رنگ کوماسی بلو R250 در یک ارلن ریخته و با آب مقطر به حجم ۲ لیتر رسانده شد. سپس بر روی استیرر قرار گرفت تا محلول با رنگ خوب مخلوط شود. برای جلوگیری از تابش نور به محلول درون ظرف، ظرف با کاغذ آلومینیومی پوشانده شد و در دمای اتاق نگه‌داری گردید. کوماسی بلو R250 یک رنگ آمینوتری‌آریل‌متان است که به صورت محکم (اما نه به صورت کووالانسی) به کمپلکس پروتئین‌ها از طریق میان‌کنش‌های واندروالسی و الکترواستاتیک با گروه متصل می‌شود. ساختار این رنگ به صورت غالب غیرقطبی است بنابراین در اتانول و اسیداستیک تهیه می‌شود. تثبیت کننده پروتئین‌ها در ژل اسیداستیک است.
۲-۱۳-۱-۳- تهیه محلول رنگ‌بر
برای تهیه این محلول ۶۰۰ میلی‌لیتر اتانول، ۱۰۰ میلی لیتر اسیداستیک خالص را با ۱۳۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر خالص به حجم ۲ لیتر رسانده سد.
۲-۱۳-۱-۴- تهیه بافر نمونه
برای بافر نمونه این روش از محلول اوره ۷ مولار که دارای ۵/۰% مرکاپتواتانول و ۳۰۰ ساکارز است، استفاده می‌کنیم.
۲-۱۳-۱-۵- تهیه محلول اوره ۹ مولار
یرای تهیه ۱۰ میلی‌لیتر از این محلول باید ۴/۵ گرم اوره را به حجم ۱۰ میلی‌لیتر رساند. از آن جایی که این حل شدن واکنشی گرماگیر است، معمولا حل کردن اوره در دمای ۴۰ انجام می‌شود. ولی روش بهتر آن است که اوره در تعداد دفعات بیشتر و هر بار به میزان ۵/۰ گرم به محلول اضافه کرده و تحت هم‌زدن شدید قرار داده تا به طور کامل حل شود.
۲-۱۳-۲- تکنیک UREA-PAGE
تکنیک UREA-PAGE به ترتیب مراحل زیر انجام می‌شود:
۱) اسلایدهای شیشه‌ای مخصوص ساخت ژل را به خوبی شسته و در نهایت برای حذف هر گونه آلودگی با اتانول ۷۰% تمیز کرده.
۲) سپس اسلایدهای شیشه‌ای را در داخل سلول مخصوص خود قرار داده به طوری که قسمت U شکل اسلاید به سمت داخل سلول باشد. سپس پیچ‌های سلول را می‌بندیم تا سلول در جای خود ثابت شود.
۳) سلول را بر روی پایه مخصوص خود قرار داده و برای اطمینان از عدم نشت ژل، مقداری اتانول در اسلایدهای شیشه‌ای ریخته و به مدت ۱۰ دقیقه در آن قرار می دهیم و در صورت عدم نشت ژل با احتیاط،اتانول واقع در اسلایدهای شیشه‌ای دور ریخته می‌شود.
۴) سپس با بهره گرفتن از جدول ۲-۴ اقدام به ساخت ژل تفکیک کننده صورت گرفت. ترتیب اضافه کردن مواد برای تهیه ژل تفکیک کننده از این قرار است: بافر تریس اسیدکلریدریک pH ۸/۸، محلول آکریل‌آمید، محلول اوره و تمد می‌باشد. سپس این مواد قبل از ریختن درون اسلاید خوب مخلوط می‌شوند.لازم به ذکر است که تمد را قبل از ریختن ژل درون اسلاید اضافه می‌کنیم زیرا پس از افزودن تمد، ژل به سرعت می‌بندد.
جدول ۲-۴، ترکیب ژل تفکیک کننده برای UREA-PAGE