۱۴≥

۱۸-۱۵

۱۹≤

سیپروفلوکسازین(CEP)

۵

۱۵≥

۲۰-۱۶

۲۱≤

۳-۸-بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین
باکتری های مشکوک به HLGR با روش غربالگری دیسک دیفیوژن جداسازی شدند. در این روش ابتدا یک کشت تازه با غلظت نیم مک فارلند تهیه شده و با سوآپ استریل بر روی محیط کشت مولرهینتون آگار کشت خطی داده شد.سپس دیسک های جنتامایسین (۱۲۰ میکروگرم) و استرپتومایسین(۳۰۰ میکروگرم) بر روی محیط کشت قرار داده شدند. پلیت ها در ۳۷ درجه ی سلسیوس و به مدت ۲۴ ساعت گرم خانه گذاری شد.سپس قطر منطقه ی عدم رشد با خط کش اندازه گیری شد. مقاومت با رشد کامل در اطراف دیسک گزارش شده و حساسیت با منطقه ممانعت از رشد بیشتر از ۱۰ میلی مترگزارش شد. مناطق ممانعت از رشد بین۷ تا۹ میلی متر نیز به عنوان حدواسط در نظر گرفته شدند. از E.faecalis ATCC 2912 به عنوان شاهد حساس و از E.faecalis 51299 به عنوان شاهد مقاوم و کنترل استفاده شدند.
۳-۹-اجرای PCR
۳-۹-۱-آماده سازی واستخراج ژنوم
از روش جوشاندن جهت استخراج ژنوم باکتری انتروکوک استفاده شد. در ادامه به شرح روش انجام شده برای استخراج ژنوم انتروکوک ها پرداخته می‏شود.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۹-۱-۱-جوشاندن
۱)۱۵۰ میکرولیتر سرم فیزیولوژی را در میکروتیوپ ۵/۱ میلی لیتری استریل ریخته شد.
۲) یک لوپ از کشت خالص باکتری به میکروتیوپ انتقال داده شد.
۳) به مدت ۱ دقیقه ورتکس دستی انجام شده تا مخلو ط یک دستی از باکتری و سرم فیزیولوژی ایجاد شود.
۴) میکروتیوپ به مدت ۲۰ دقیقه در آب جوش با دمای ۱۰۰ درجه سلسیوس قرار داده شد .
۵) به سرعت میکروتیوپ در دستگاه سانتریفیوژ با دور ۱۳۰۰۰ به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده شد.
۶) محلول رویی که حاوی DNA باکتری می باشد به کمک سمپلر با دقت جدا کرده و به یک میکروتیوپ استریل دیگر انتقال می دهیم .
۷) در نهایت، محصول استخراج شده روی ژل آگاروز ۱ درصد الکتروفورز شد.
۳-۱۰-اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده به روش کمی
با این روش می توان غلظت نمونه DNA را به کمک جذب نوری آن در طول موج nm260 و با بهره گرفتن از رابطه زیر به دست آورد. به این منظور از دستگاه اسپکتروفوتومتر(Termo scientific price)Drop_ Nano استفاده شد. چنانچه در مراحل استخراج DNA ، از RNase برای از بین بردن RNA استفاده شده باشد ، جذب نوری در nm 260 ،فقط میزان DNA را نشان خواهد داد . در این طول موج یک واحد جذب ، معادل ۵۰ میکروگرم DNA در هر میلی لیتر است . جذب نوری در طول موج nm280 نیز وجود پروتئین در نمونه را اثبات می کند . جذب اشعه ماوراء بنفش برای بررسی خلوص DNA حاصل هم استفاده می شود . به این صورت که با بررسی نسبت جذب نوری نمونه در nm260 به جذب آن در nm280 می توان خلوص DNA استخراج شده را تعیین کرد . چنانچه عدد به دست آمده از این نسبت بین ۲-۵/۱ باشد ، DNA خالص ، و اگر کمتر از ۵/۱ باشد ، نمایانگر آلودگی نمونه استخراج شده با پروتئین خواهد بود . اعداد بالاتر از ۲ نشانگر آلودگی با فنل یا RNA هستند.
نکته :جذب نوری در طول موج nm230،شاخص آلودگی نمونه با اوره و یا اجزاءآروماتیک پروتئین ها می باشد . اساس UV اسپکتروفتومتری می تواند به طور اتوماتیک غلظت DNA رابا استفاده از جذب نوری در طول موج nm260 ، محاسبه کند . به این صورت که پس از آماده سازی نمونه و قرار دادن آن در مکان قرار گیری نمونه ، دستگاه غلظت نمونه مورد نظر را در طول موج مربوطه محاسبه می نماید.
۳-۱۱- اندازه گیری کیفی غلظت DNA ژنومیک
جهت تایید وجود ژنوم در نمونه استخراج شده ،پس از ترکیب محصول استخراج ژنوم با Buffer Loading به نسبت ۵ به ۱ به کمک سمپلر در چاهک ها ریخته شد . درب تانک الکتروفورز (Rad Bio) را بسته و برای مدت ۵ دقیقه ولتاژ را بر روی V 100 تنظیم کرده و سپس برای مدت ۴۰ دقیقه ولتاژ را بر روی ۸۰ رسانده می شود، سپس ژل در دستگاه Gel documantion خوانده شد.
۳-۱۲-انتخاب و سنتز پرایمر
برای این منظور کلیه مقالات قابل دسترسی مربوط به تشخیص وجود سه ژن aac(6′)-Ie-aph(2′’)-Ia و aph(3′)-IIIa و ant(4)-Ia به روش مولکولی (PCR) مطالعه شد. با بررسی و انتخاب پرایمر های مورد نظر جفت پرایمرهای ارائه شده در مقاله رفرانس، جهت تعیین میزان همولوژی ناحیه انتخاب شده با ژنوم سایر گونه ها ی مختلف باکتریایی و از سایت اینترنتی به نام http://www.ncbi.nlm.nih.gov و Blast استفاده و تعیین ترادف انجام گردید . همچنین جهت ارزیابی خصوصیات پرایمرها از نظر لوپ و از برنامه نرم افزارهای مولکولی Oligo و Gene runner استفاده گردید. سرانجام جهت سنتز سکانس نوکلئوتیدی پرایمر به شرکت تحقیقاتی سینا کلون (سینا ژن ) سفارش ساخت داده شد.
جدول(۳-۶) پرایمرهای استفاده شده برای پیدا کردن سویه های انتروکوکی مقاوم به آمینوگلیکوزیدی

ژن موردنظر

توالی پرایمر (bpطول قطعه(

aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia

۵’-CAGGAATTTATCGAAAATGGTAGAAAAG-3′ 369
۵’-CACAATCGACTAAAGAGTACCAATC-3′

aph(3′)-IIIa