شکل۲۸: دیاگرام جابلونسکی. حالت های الکترونی مولکول، زیر حالت های ارتعاشی و انتقالات بین این حالت ها.
۲-۹-۵- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD)
روش طیف سنجی CD به طور گسترده ای در ارزیابی ساختار و پایداری پروتئین ها در شرایط مختلف محیطی از نظر دما، قدرت یونی، وجود املاح و مولکول های کوچک مورد استفاده قرار می گیرد. در حال حاضر انجام این تکنیک بدلیل اینکه نسبتا آسان است و نیاز به مقدار کمی از نمونه دارد و هم چنین تجزیه و تحلیل داده ها سریع می باشد، تقریبا در همه آزمایشگاه های درگیر با تجزیه و تحلیل پروتئین ها به طور عمده فراهم است. این تکنیک عمدتا برای مطالعه ساختار دوم پروتئین ها استفاده می شود، هر چند از آن می توان برای مطالعه ساختار پپتیدها و نوکلئیک اسیدها نیز استفاده نمود. مطالعه پروتئین ها با این تکنیک حتی با یک غلظت پایین نمونه (۱۰ - ۱ میلی گرم / میلی لیتر) در یک گسترده وسیعی از متغیرهای محیطی (دما، pH، و غیره) قابل انجام است. هم چنین این روش می تواند اطلاعاتی را در مورد اثر لیگاندهای اضافه شده به پروتئین نشان دهد. در مورد پروتئین ها نتایج معمولا به صورت مولار الیپتیسیتی Ellipticity)) بیان می شوند و با نماد  [θ]نشان داده می شود که از فرمول زیر قابل محاسبه می باشد:

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

در این فرمول الیپتیسیتی با θ ، مسیر نور عبوری بر حسب سانتی متر باl ، جرم مولکولی با M، غلظت پروتئین بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر با C، و تعداد رزیجوهای آمینواسید با n نشان داده شده است. درنهایت [θ]بر حسب deg.cm ^۲ .dmol ^-۱ بدست می آید (۱۲۴).
۲-۹-۶- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون
۲-۹-۶-۱- دناتوراسیون
دناتوراسیون پروتئینی (شکل ۲۹) می تواند یک فرایند برگشت پذیر و یا غیر قابل برگشت باشد. دناتوراسیون در واقع به تغییری که در کنفورماسیون پروتئین ایجاد شود و منجر به آنفولد شدن کل ساختار پروتئین شود اطلاق می شود. علاوه براین، چنین تغییراتی بدون شکستن پیوندهای پپتیدی رخ می دهد. در این شرایط پروتئین بدلیل از دست دادن ساختار سوم خود فعالیت بیولوژیکی ندارد. از طرفی دناتوراسیون منجر به در معرض قرار گرفتن گروه های هیدروفوبیکی می شود که این امر تمایل جذب سطحی نقاط هیدروفوبیکی پروتئین ها را به یکدیگر و تشکیل و تجمع رسوب پروتئینی را افزایش می دهد (۱۲۵).

شکل ۲۹: دناتوراسیون پروتئینی.
۲-۹-۶-۲- مطالعه ی پایداری پروتئین ها
در تحقیقات بیومولکولی نظیر مهندسی پروتئین، شیمی پروتئین، کشف و طراحی داروها، تعیین فاکتورهای موثر در پایداری پروتئین ها اهمیت بالقوه ای دارد. در این تحقیقات از روی پارامترهایی نظیر تغییرات انرژی آزاد گیبس (°( ΔG و نیز ویژگی هایی که یک پروتئین در حین عبور از حالت طبیعی و فولد شده به حالت غیرطبیعی و آنفولد شده در حین دناتوراسیون پیدا می کند می توان پایداری ترمودینامیکی را مشخص کرد.
در بین پارامترهایی که پایداری یک پروتئین را تعیین می کنند، می توان به موارد زیر اشاره نمود از جمله به پیوندهای هیدروژنی، تعاملات هیدروفوبیک، پیوندهای واندروالسی، پل های نمکی و تعاملات آروماتیکی که همگی بستگی به نوع ترکیب آمینواسیدهای یک پروتئین دارند و نیز تغییرات پس از ترجمه نظیر گلیکوزیله شدن و متیله شدن که روی پروتئین ایجاد می شوند، همچنین یکسری فاکتورهای محیطی نظیر دما، فشار، نمک ها، PH وغیره هستند که روی پایداری یک پروتئین تاثیر می گذارند. به عنوان مثال اضافه نمودن یک ماده ی شیمیایی نظیر گوانیدین هیدروکلراید و یا اوره منجر به دناتوره شدن پروتئین و متعاقب آن تغییر در پایداری پروتئین می شود (۱۲۷-۱۲۶).
۲-۹-۶-۳- روش دناتوراسیون شیمیایی
اوره و گوانیدین هیدروکلراید ترکیباتی هستند که به طور معمول جهت دناتوراسیون شیمیایی به کار گرفته می شوند ( شکل۳۰). این ترکیبات با تخریب پیوند های هیدروژنی منجر به آنفولد شدن پروتئین ها می شوند. در غلظت های بالا از این دناتوره کننده ها به عنوان مثال غلظت ۸ مولار برای اوره وغلظت ۴ مولار برای گوانیدین هیدروکلراید، پروتئین ها تمایل به آنفولد شدن دارند. در حقیقت دناتوراسیون شیمیایی منجر به از دست رفتن پایداری در پروتئین می شود. در حین دناتوراسیون شیمیایی ساختار اولیه پروتئین دست نخورده باقی می ماند. اما ساختارهای دوم وسوم پروتئین دستخوش تغییر می شوند. در این حالت پروتئین از حالت فولد شده به یکی از دوحالت نسبتا فولد شده و کاملا آنفولد شده می رسد. همچنین وجود مرحله ی حد واسط هم در این واکنش از طریق مطالعات دناتوراسیون شیمیایی قابل بررسی می باشد. فرایند آنفولدینگ بعضی پروتئین ها در حضور گوانیدین هیدروکلراید سه حالت گذار را نشان می دهد، شامل مرحله ی (N) NATIVE، حد واسط (I) و مرحله ی آنفولد شده (U). وجود مرحله ی حدواسط در حین دناتوراسیون نشان دهنده ی پروتئین در حالت کره ی مذاب می باشد که دارای ساختار ثانویه ای مشابه با حالت NATIVE است که این امر توسط تکنیک دورنگ نمایی حلقوی با تعیین درصد محتوای آلفا هلیکس، صفحه های بتا و راندوم کویل ها تایید شده است (۱۲۸).

شکل ۳۰: ساختار شیمیایی اوره و گوانیدین هیدروکلراید. ترکیباتی که به طور معمول جهت دناتوراسیون شیمیایی به کار گرفته می شوند.
۲-۹-۶-۴- روش دناتوراسیون دمایی
یک چارچوب ترمودینامیکی مشخص برای دناتوراسیون دمایی وجود دارد که بیان کننده ی وابستگی انرژی آزاد گیبس به درجه حرارت می باشد. از نظر عملی روش دناتوراسیون دمایی بسیار مناسب است به این دلیل که حین انجام این آزمایش نیاز به تغییر در ترکیب نمونه تحت آزمایش نمی باشد. هرچند نمی توان از این امر چشم پوشی کرد که بسیاری از پروتئین ها با بالا رفتن دما تمایل به جمع شدن و تشکیل رسوب را در نمونه پیدا می کنند و ترکیب نمونه را تحت تاثیر قرار می دهند (۱۲۹).
۲-۱۰- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب
۲-۱۰-۱- کاربرد پروتئین های نوترکیب
پروتئین ها در بدن دارای نقش بسیار مهم و گسترده ای در فرآیندهای بیولوژیک، انتقال مواد به درون سلول ها و بیرون از آن، تشکیل گیرنده های سلولی، تسریع واکنش های بیوشیمیایی و فرایند پیام رسانی بر عهده دارند. تاکنون ۲۵۰۰۰ الی ۴۰۰۰۰ ژن در بدن انسان تخمین زده شده است و با برآورد نقش ژن ها و تعداد زیادی از پروتئین های حیاتی که خود بر مبنای تغییرات ساختمانی مولکول های بسیار زیادی را تولید می کنند می توان به تعداد بیشتر آنها در بدن پی برد.
۲-۱۰-۲- پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins )
روش های تولید پروتئین های نوترکیب به عنوان روش های مورد نیاز و اساسی در علم بیوتکنولوژی امکان تولید بسیاری از مولکولهای حیاتی مانند داروها، انسولین و پروتئین های خون، هورمونها مثل هورمون های رشد و واکسن ها و غیره را فراهم می نماید. برای تولید پروتئین های نوترکیب از تکنیک های کلونینگ مولکولی استفاده می شود که در آن ژن مورد نظر توسط حامل هایی به نام وکتور درون باکتری های مخصوصی وارد شده تا به عنوان جزئی از ژن باکتری و به همراه آن تکثیر شده و پروتئین مورد نظر همراه با سایر پروتئین های باکتری بیان شود. سپس با روش های مختلف کروماتوگرافی ستونی پروتئین ها خالص سازی شده و خصوصیات آن از لحاظ فعالیت بیولوژیکی و ساختمانی با روش هایی مانند روش ELISA مورد بررسی قرار میگیرد. پس از طی مراحل ذکر شده پروتئین مذکور به عنوان دارو، مکمل یا در زمینه های تحقیقاتی مورد استفاده قرار می گیرد (۱۳۰).
محصولات نوترکیب که با دستکاری های ژنتیکی و تغییرات  DNAدر موجودات مختلف همراه است موجب تحول عظیمی در نوع و تنوع فرآورده های دارویی مورد مصرف شده است به طوریکه امروزه شاهد مصرف فرآورده های نوترکیب دارویی با وزن مولکولی بالا به جای مولکول های شیمیایی کوچک دیروز هستیم. داروهای پروتئینی دارای عملکرد بسیار اختصاصی هستند، لذا بر روی سایر فرآیندهای بیولوژیک غیر مرتبط اثر سوئی نخواهند گذاشت و از این نظر کمتر دارای عوارض جانبی هستند (شکل ۳۱).
شکل ۳۱: پروتئین های نوترکیب و مزایا.
دو مزیت که برای پروتئین های درمانگر وجود دارد سبب شده تا دور نمای اقتصادی بسیار جالبی برای آنها نسبت به داروهای متداول ترسیم شود. اکثر داروهای پروتئینی حاصل فناوری DNA نوترکیب است مگر برخی از موارد کم مانند آنزیم های پانکراس و یا مهار کننده های آلفا-یک پروتئاز که از استخراج بافت های حیوانی و پلاسمای انسانی بدست می آید. سیستم های بیولوژیکی که از آن ها پروتئین های نوترکیب بدست می آیند عبارت از انواع باکتری ها، مخمرها، سلول های جانوری و حشرات و گیاهی و سلول های حاصل از حیوانات دستکاری شده ژنتیکی میباشد. مرحله دیگری که از این پروتئین ها میتوان فرآورده های اصلاح شده بدست آورد عبارت است از بهینه کردن آن ها بر مبنای گلایکوزیله کردن، فسفریلاسیون و تجزیه پروتئولیتیک. بطور مثال باکتری ها نمیتوانند واکنش های گلایکوزیله شدن انجام دهند. لذا بر مبنای هر یک از تغییرات فوق میتوان پروتئین اصلاح شده ای را با مزایای بیشتری بدست آورد(۱۳۱).
مولکول انسولین اولین دارویی بود که بر مبنای آن تمایل به تغییرات و بهینه سازی آن ایجاد شد. سابق بر این انسولین حاصل استخراج و خالص سازی از پانکراس بود و این نوع فرآورده ها حداقل سه عدم مزیت را با خود داشت. اول آنکه محدودیت حیوانی برای استخراج برای آنها وجود دارد و دوم اینکه هزینه این نوع استخراج از حیوان زیاد و نیازمند صرف وقت بوده و اینکه در برخی مواقع نسبت به این نوع فرآورده ها آلرژی همراه با پاسخ عدم تحمل پذیری وجود دارد .
این محدودیت ها باعث شد تا تحقیقات بر مبنای جدا سازی ژن تولید کننده انسولین انسانی حاصل صورت گیرد و سپس ژن مدنظر در E.Coli  با مهندسی ژنتیک وارد شود که سبب تولید انسولین انسانی از طریق فناوری DNA  نوترکیب گردید. در نهایت این فناوری موجب شد تا انسولین انسانی با مزایای کم هزینه تر و در دسترس تر و با حالت خطر کمتر و با ایمنی زایی همراه به طور صنعتی تهیه شود (۱۳۲).
پروتئین های نوترکیب نسبت به سایر پروتئین ها دارای مزیت هایی هستند. یکی از این مزیت ها آن است که نسخه کپی شده و بازنویسی شده از ژن انسانی میتواند همانند دقیقی از ترکیب طبیعی بدن باشد و بطور اختصاصی عمل نماید و نسبت به آن نیز واکنش ایمنی کمتری در بدن داشته باشد. ثانیا پروتئین های نوترکیب بطور موثرتر و با هزینه کمتری و با فراوانی بیشتری تولید میشوند. یکی از موارد کاربرد فرآورده های نوترکیب در درمان بیماری گوشه Gaucher’s disease)) است. این عارضه ژنتیکی و نقص متابولیکی لیپیدی در اثر کمبود آنزیم بتا گلوکوروسربروزیداز بوجود می آید و سبب بزرگ تر شدن کبد و طحال می گردد و در پوست بدن نیز زخم هایی همراه رنگ دانه هایی ایجاد می شود. این آنزیم در ابتدا از جفت انسانی استخراج و حاصل می شد. برای درمان یک بیمار در سال نیاز بود تا این آنزیم از ۵۰۰۰۰ جفت انسانی استخراج و خالص سازی شود که از نظر عملی کار بسیار زیادی لازم بود. آنزیم بتا گلوکوروسربروزیداز بصورت نوترکیب تهیه شد و این آنزیم با این فناوری نه تنها به حد کافی تولید میشود بلکه خطر انتقال عوامل ویروسی نیز از بین رفت (۱۳۳).
۲-۱۰-۳- تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان
از آنجائیکه یک ژن می تواند در سیستم های گوناگونی بیان گردد، بنابراین تعیین سیستمی با بیشترین بازده تولید پروتئین های نوترکیب امری ضروری در نظر گرفته می شود. تعیین بهترین سیستم بیان کننده پروتئین های نوترکیب یکی از مباحث مهم در بیوتکنولوژی است. یک سیستم بیان کننده پروتئین های نوترکیب باید بتواند مواد زیستی را با بیشترین فعالیت بیولوژیکی و ایمنی و کمترین هزینه تولید کند. در حال حاضر بعضی از شرکت های معروف برای تولید پروتئین های نوترکیب از سیستم های فرمانتاسیون باکتری ها (مانند E. coli) یا سلول پستانداران استفاده می کنند. اما این سیستم ها دارای محدودیت هایی هستند. سیستم های بیانی که جهت تولید پروتئین های نوترکیب از سلول های پستانداران استفاده می کنند، فرآورده های را به وجود می آورند که کاملاً مشابه آن هایی است که بطور طبیعی در بدن انسان سنتز می شوند.
اما چون کشت این سلول ها گران تمام می شود، این سیستم در مقیاس محدود قابل اجرا است. کاربرد میکروارگانیسم ها مانند باکتری ها باعث می گردد که پروتئین های نوترکیب در مقیاس وسیع تولید شوند؛ اما مهمترین مشکل این سیستم ها این است که فرآورده های حاصل به طور محسوسی با فرآورده های طبیعی انسانی اختلاف دارند. برای مثال، پروتئین هایی که معمولاً در انسان گلیکوزیله می شوند، به وسیله باکتری ها گلیکوزیله نمی گردند، زیرا باکتریها فاقد امکانات سلول های یوکاریوتی جهت انجام اصلاحات پس از ترجمه هستند. پردازش پس از ترجمه برای فعالیت زیستی تعداد زیادی از پروتئین های انسانی از جمله آنتی بادی ها لازم است. گیاهان واریخته جایگزین مناسبی برای سیستم های رایج بیان کننده پروتئین های نوترکیب همچون کشت سلول های جانوری و پروکاریوتی هستند. گیاهان واریخته دارای ژن یا ژن هایی هستند که بطور مصنوعی به آن ها الحاق شده است. آزمایش های پزشکی نشان می دهند که پروتئین های تولید شده در گیاهان از نظر فعالیت های زیست شناختی و ساختمانی با پروتئین های مشابه که از سیستم های کشت سلول های انسانی و حیوانی بدست آمده اند، قابل مقایسه هستند (۱۳۵-۱۳۴).
۲-۱۰-۴- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین
رایج ترین ارگانیسم مورد استفاده برای بیان پروتئین ها باکتری ایشریشیاکلی است. تمام مواردی که موجب افزایش بیان پروتئین در ایشریشیاکلی می شوند در سیستم های بیانی دیگر نیز بکار گرفته می شوند. عواملی نظیر سرعت رشد بالا، آسانی کار با این میکروارگانیسم، رشد در محیط کشت نسبتا غنی و بی ضرر بودن برای انسان و یا محیط زیست کار با این میکروارگانیسم را آسان می کند (۱۳۶).

شکل ۳۲: استفاده ازاشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین.
۲-۱۰-۵- خالص سازی پروتئین های نوترکیب
زمانی که میزان بالایی از پروتئین داخل سلول تولید شد برای اینکه بتوان جزئیات پروتئین بیان شده را مورد مطالعه قرار داد نیاز است که خالص سازی پروتئین در سطح مطلوبی صورت بگیرد. این بدان معنی است که می بایست پروتئین های مورد نظر ما از سایر اجزای سلول از جمله تمام پروتئین های دیگر جدا شود. تخلیص پروتئین یک فرایند پیچیده می باشد و نیاز به درجه بالایی از مهارت و تجربه دارد، همچنین پروتکل های تخلیص پروتئین اغلب با تلاش بی وقفه بدست آمده و تست شده اند. اکثر پروتکل ها تکیه بر پیدا کردن ویژگی خاصی از پروتئین ها دارند که می تواند به تدریج پروتئین مورد نظر را از تمام پروتئین ها و اجزای دیگر سلولی تفکیک کند. استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی یک روش تخلیص پروتئین است. این روش به طور گسترده برای طیف وسیعی از پروتئین هایی با خواص متفاوت قابل اجرا است. در کروماتوگرافی میل ترکیبی، اضافه نمودن اسید آمینه های خاص به پروتئین یک ویژگی جدید می دهد که موجب اتصال محکم آن به یک ماده خاص می گردد. یک مثال رایج استفاده از “His tag” برای کمک به خالص کردن یک پروتئین است. این تگ یک رشته (معمولا شش تا) از رزیجوهای هیستیدین است که به پایانه N و یا پایانه C پروتئین ها اضافه می گردد. همچنین در حال حاضر پلاسمیدهایی به صورت تجاری در دسترس هستند که حاوی کدون خود تگ می باشند. حضور این آمینواسید های اضافی در پروتئین اغلب هیچ گونه تداخلی با عملکرد طبیعی پروتئین ندارد و موجب اتصال محکم پروتئین به یونهای فلزی مانند نیکل می شود. به صورت تجاری رزین های که به یون فلزی نیکل اتصال دارند جهت تخلیص پروتئین های دارای تگ هیستیدین مورد استفاده قرار می گیرند. در روش کروماتوگرافی میل ترکیبی سلول های ای کلای از ستون حاوی رزین های نیکل عبور داده می شود و پروتئین های داری تگ هیستیدین به یون نیکل متصل می گردند، سپس برای آزاد شدن این اتصال از بافر ایمیدازول استفاده می گردد(۱۳۷).
هدف از انجام این پایان نامه بیان و تخلیص پروتئین نوترکیبFGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم می باشد. قابل ذکر است که تهیه ی ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئین FGFR2b به صورت خالص این امکان را فراهم می کند که در مطالعات بعدی بتوان اطلاعاتی راجع به ساختار و نیز بررسی برهمکنش پروتئین و لیگاند از جمله اثر مهارکننده های مختلف را روی ناحیه ی کینازی این پروتئین به دست آورد. همچنین مشخص شدن عوامل موثر در تغییر ساختار پروتئین نوترکیب FGFR2b می تواند در درمان سرطان ها و برخی بیماری ها موثر باشد.
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش
در این تحقیق تجربی که در سال ۳-۱۳۹۲ در دانشگاه علوم پزشکی قزوین صورت گرفت، پلاسمید pLEICS-01 که حاوی ژن ناحیه‏ تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b بود توسط محقق آقای دکتر داریوش ایلغاری، با بهره گرفتن از cDNA ژن FGFR2b سالم تهیه شد و به این طرح هدیه شد. ایمیدازول، IPTG و Ni²⁺-NTA از شرکت سیگما، آمپی‏سیلین و HEPES از شرکت مرک و باکتری ایشریشیا کلی BL21(DE3) از شرکت Invitrogen تهیه شدند. کلرید کادمیوم، کلرید آلومینیوم، نیترات سرب، نیترات نیکل و گوانیدین هیدروکلراید (GdnHCl) از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شدند. بقیه مواد شیمیایی مورد استفاده از نوع خالص بودند و از شرکت سیگما و شرکت مرک تهیه گردیدند.
۳-۱-۱- مواد مورد استفاده در آزمایش

1. محیط کشت LB Broth، جهت کشت باکتر ی در حجم بالا